A diabetes mellitus (DM) tipo 1 é uma doença comum em homens e cães, com complicações sérias e sem cura. Os tratamentos disponíveis apresentam limitações e não mimetizam o controle fisiológico que a secreção de insulina, pelas células beta pancreáticas, exercem na glicemia. Neste contexto, células tronco mesenquimais (CTM) de diferentes espécies têm sido utilizadas para a diferenciação em células beta funcionais. Os cães são utilizados como modelo de estudo da DM tipo 1 humana, devido às suas similaridades quanto à apresentação e ao curso da doença. No entanto, nesta espécie, pouco se sabe sobre a diferenciação in vitro das CTM em células produtoras de insulina (CPI). O objetivo deste estudo foi diferenciar células tronco mesenquimais do tecido adiposo (CTM-TA) de cães em CPI, por diferentes composições do meio de cultura, a fim de determinar a que promove melhor diferenciação. As células isoladas da gordura peri-uterina, após a terceira passagem, apresentaram características de CTM, como elevada expressão de CD90 e CD29 e baixa expressão de CD45 e CD34, além da capacidade para se diferenciar em adipócitos, condroblastos e osteoblastos. As CTM-TA foram distribuídas em seis grupos, de acordo com os meios de cultura: 1) DMEM/F12 alta glicose sem soro fetal bovino (SFB), ß-mercaptoetanol e nicotinamida; 2) DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß- mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4; 3) DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß-mercaptoetanol, nicotinamida, exendin-4, suplemento B27, aminoácidos não essenciais e L-glutamina; 4) cultivo em duas etapas, sendo a primeira (8 dias), com DMEM/F12 alta glicose sem SFB, ß-mercaptoetanol, nicotinamida e a segunda, (9-16dias), com o mesmo meio, acrescido de exendin-4, suplemento B27, aminoácidos não essenciais, L-glutamina e FGFb; 5) DMEM/F12 alta glicose sem SFB e 6) DMEM/F12 baixa glicose com 10% de SFB (controle negativo). Durante a diferenciação, as células foram observadas e fotografadas aos 3, 6, 10, 13 e 16 dias. Aos 16 dias, as culturas de células foram coradas por hematoxilina-eosina e por dithizone, marcador da insulina. Foi também avaliada, por RT-PCR, a expressão dos transcritos gênicos, expressos em células beta pancreáticas, como PDX-1, BETA 2, MafA e Insulin. Durante o cultivo, as CTM-TA dos grupos 1 ao 5 tornaram-se gradualmente mais arredondas e reunidas em clusters, semelhantes às ilhotas pancreáticas. Tais mudanças ocorreram de forma diferenciada entre os grupos, sendo que no grupo 3, os clusters de células eram aparentemente mais numerosos, e formavam agregados maiores. Mas, pela coloração por dithizone, os grupos 3 e 4 foram semelhantes com relação ao tamanho da área média corada para insulina. No entanto, somente o grupo 4 apresentou número de agregados de insulina e área total de insulina corada, significativamente maior em comparação aos demais grupos. Houve também expressão de PDX-1, BETA2/NEUROD, mafA e Insulin nos grupos estudados. Conclui-se que, por manipulação da composição do meio de cultivo, é possível induzir a diferenciação das CTM-TA caninas em CPI e que no grupo 4, onde o cultivo foi realizado em duas etapas, houve a melhor diferenciação das CTM-TA em CPI.