O processo produtivo em estabelecimentos de produtos de origem animal está relacionado com a presença de bactérias patogênicas e deteriorantes, mesmo em ambientes controlados. Alguns micro-organismos patogênicos possuem a capacidade de adesão e formação de biofilmes em superfícies de diferentes naturezas, com consequente persistência e contaminação cruzada, o que oferece riscos para a saúde pública. Estas estruturas, em condições naturais, normalmente envolvem diversas espécies bacterianas e proporcionam interações complexas que podem comprometer a eficácia dos sanitizantes utilizados na higienização industrial. Aliado a isso, poucos estudos são direcionados para a tolerância conferida por biofilmes mistos, além de pouco se comparar as diferenças entre biofilmes mistos e puros. Assim, o objetivo do trabalho foi avaliar a ação da biguanida e do ácido peracético em diferentes concentrações sobre biofilmes puros e mistos formados por L. monocytogenes e S. Typhimurium. Para isso, foram utilizadas três cepas de L. monocytogenes e uma de S. Typhimurium, todas isoladas do mesmo ambiente de processamento de carne suína em estudos prévios. Inicialmente, foi determinada a concentração inibitória mínima (CIM) das culturas puras e mistas para os dois sanitizantes sobre células planctônicas. Os biofilmes foram induzidos em polipropileno com as culturas puras e mistas e incubados a 12°C e 37°C. Após 120 horas de formação, os biofilmes foram tratados com a CIM e as concentrações mínimas e máximas recomendadas. Também foi realizada microscopia eletrônica de varredura para observação das estruturas e da ação dos sanitizantes. Todos os isolados testados apresentaram a mesma CIM para a biguanida (0,05%) e para o ácido peracético (0,02%). Todas as concentrações testadas resultaram em menores populações residuais quando comparadas aos controles positivos (p<0,05), contudo, nenhum tratamento foi capaz de eliminar totalmente as células bacterianas em biofilme. Os biofilmes puros de L. monocytogenes foram mais populosos do que o respectivo patógeno em biofilmes mistos com S. Typhimurium, porém em geral resultaram em menores populações residuais após os tratamentos. Este resultado torna possível inferir que S. Typhimurium conferiu efeito protetor à L. monocytogenes em culturas mistas. Além disso, a formação de biofilmes foi semelhante para culturas puras e mistas, mas as populações residuais após os tratamentos foram maiores em biofilmes mistos, na maioria das combinações. O ácido peracético se mostrou mais eficaz na redução dos biofilmes do que a biguanida em suas CIM. A microscopia eletrônica de varredura mostrou uma arquitetura mais complexa em biofilmes mistos, que pode justificar a proteção de L. monocytogenes conferida por S. Typhimurium e também o maior número de células das culturas mistas após a maioria dos tratamentos, que foi possível observar tanto na contagem em placas, quanto na microscopia. Assim, apesar da diferença significativa entre populações residuais e os controles, neste estudo os patógenos apresentaram uma interação positiva em culturas mistas, o que reforça a importância do monitoramento dos protocolos de higienização e de estudos para proporcionar medidas de controle de biofilmes cada vez mais eficazes e que não induzam à tolerância.