Biofilmes multiespécies são ecossistemas microbianos complexos que podem ser fonte de contaminação entre ambientes industriais e alimentos. O estudo, teve como objetivos realizar a caracterização molecular e avaliar expressão de genes relacionados à formação de biofilme, bem como, a dinâmica de formação e arquitetura de biofilmes puros e mistos de Listeria monocytogenes e Salmonella Typhimurium. Os três isolados de L. monocytogenes foram submetidos a caracterização de genes relacionados a formação de biofilme (flaA, prfA, luxS, agrA, agrB, agrC, agrD), a resistência a biocidas (mdrT, mdrM, mdrL, idE), a adaptação ao pH e a concentrações de sal (SSI-1 lmo 0444, SSI-1 lmo 0445, SSI-1 lmo 0446). Um isolado de S. Typhimurium foi submetido a avaliação de genes envolvidos na produção de fímbrias, adesão, virulência, formação de celulose e biofilme (adrA, lpfA, agfA, sipA), a quorum sensing (sidA) e a resistência ao amônio quaternário (qacEΔ1). A dinâmica de formação de biofilmes puros e mistos foi avaliada nos tempos de 1 h, 24 h, 96 h e 120 h em superfície de polipropileno a 12 °C e 37 °C. Os biofilmes maduros de L. monocytogenes na condição pura e associada com S. Typhimurium em superfície de polipropileno a 12 °C e 37 °C foram submetidos a expressão dos genes flaA, prfA, luxS e agrABCD. Os isolados de L. monocytogenes apresentaram os genes flaA, prfA, luxS, agrA, agrB, agrC, agrD, mdrT, mdrM, mdrL e idE, e S. Typhimurium carreava os genes adrA, lpfA, agfA, sipA, sidA. O crescimento planctônico e séssil de L. monocytogenes e S. Typhimurium foi relacionado a temperatura de incubação, obtendo-se contagens mais elevadas em 24 h a 37 °C, e em 96 h e 120 h a 12 °C. A adesão inicial de L. monocytogenes e S. Typhimurium foi afetada negativamente pela condição mista (p<0,001). Biofilmes puros de L. monocytogenes e S. Typhimurium apresentaram contagens mais elevadas em 96 h e 120 h quando comparados as populações individuais em biofilmes mistos. Contudo, não foi observado diferença estatística na contagem entre biofilmes puros de L. monocytogenes, puros de S. Typhimurium e a população total em biofilmes mistos (Listeria+Salmonella) a 12 °C. Em MEV, pode-se observar estrutura de aspecto viscoso promovendo a adesão (1 h) bacteriana em biofilmes mistos, e a partir de 24 h a presença de matriz exopolissacarídeos (EPS). Biofilmes puros e mistos foram capazes de manter células viáveis por 3000 h a 10 °C com contagens superiores a 120 h (p<0,05). Biofilmes maduros de L. monocytogenes não sofreram interferência da temperatura, superfície e condição mista com S. Typhimurium sobre a expressão dos genes prfA, luxS e agrBCD, contudo houve interferência na expressão de flaA e agrA. Desse modo, a caracterização da dinâmica de formação de biofilmes mistos, juntamente com presença e expressão de genes relacionados a formação de biofilme, demostrou a associação desses patógenos para a formação e manutenção de biofilmes mistos, e além disso, torna-se resultados importantes para a indústrias de alimentos e saúde pública.