Nos últimos anos, os estudos sobre a utilização de nematoides entomopatogênicos (NEPs) aumentou, tornando-se uma alternativa no controle de artrópodes de importância Médico Veterinária, pois apresenta diversas vantagens em relação ao seu uso, podendo ser utilizados isoladamente ou em conjunto com diversos produtos químicos. O presente estudo teve como objetivo avaliar in vitro a mortalidade de larvas de sete dias de Ctenocephalides felis felis (Siphonaptera: Pulicidae) por nematoides entomopatogênicos do gênero Heterorhabditis (Rhabditida: Heterorhabditidae). O estudo foi dividido em duas etapas onde, a primeira delas teve como objetivo avaliar a mortalidade de larvas C. felis felis por nematoides entomopatogênicos Heterohabditis bacteriophora (HP88), verificando a quantidade de líquido necessária (400, 600 e 1000 μL) para que os NEPs pudessem se movimentar e infectar as larvas de pulgas em três concentrações (120, 160 e 200 NEPs/larva de pulga). A segunda etapa teve como objetivo avaliar a mortalidade das larvas de C. felis felis por Heterohabditis indica (LPP30) em três concentrações (120, 160 e 200 NEPs/larva de pulga) utilizando 600 μL de solução. Os ensaios biológicos foram divididos em dois grupos experimentais, um contendo dieta específica para larvas de pulga e outro sem dieta. A análise de mortalidade foi corrigiga através da fórmula de ABBOTT e os dados paramétricos foram avaliados pela análise de variância (ANOVA), seguida do teste F ou teste de Tukey (p ≤ 0,05). Na primeira etapa do estudo utilizando H. bacteriophora (HP88) observa-se que o uso de 400 μL promoveu uma menor mortalidade das larvas de pulga quando comparado ao uso de 600 μL, sendo a média de mortalidade de 51,3 % e 69,7 % respectivamente, sugerindo que a quantidade mais adequada de líquido para infecção com NEPs e larvas de C.felis foi de 600 μL. Quando avaliados os índices de mortalidade em 600 μL os percentuais de mortalidade encontrados para as três concentrações de NEPs foram 100%; 83,3% e 83,3% respectivamente, na presença de dieta e 92,6%; 86,6% e 85,7% respectivamente, na ausência de dieta, não foram observadas diferenças significativas (p ≤ 0,05) entre os grupos experimentais com dieta e sem dieta e entre as concentrações de NEPs utilizadas. No ensaio biológico que avaliou o volume de 1000μL a mortalidade foi de 100%, inclusive nos grupos controles, sugerindo que o volume de solução utilizada não é adequado para infecção. Na segunda etapa do estudo utilizando NEPs da espécie Heterorhabiditis indica (LPP30) os percentuais de mortalidade encontrados foram 85,2%; 75% e 80% respectivamente, para as três concentrações utilizadas na presença de dieta e 81,4%; 74,0% e 93,33% respectivamente, na ausência de dieta, não sendo observada diferença significativa (p ≤ 0,05) entre os tratamentos e entre as concentrações avaliadas. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que as larvas de C. felis felis são suscetíveis a infecção in vitro por H. bacteriophora (HP88) e H. indica (LPP30) nas três concentrações de NEPs utilizadas, independente da presença ou não de dieta especifica para pulgas, podendo os NEPs ser uma ferramenta promissora no controle biológico desses insetos.