Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
MEDICINA (UROLOGIA) (33009015021P1)
INVESTIGAÇÃO CELULAR E MOLECULAR SOBRE AS CONDIÇÕES DE AGRAVO NA FERTILIDADE DO HOMEM.
LARISSA BERLOFFA BELARDIN
TESE
11/12/2019

Objetivo: Avaliar se o meio extracelular e sua interação com os espermatozoides se relacionam com as duas principais causas descritas de alteração no potencial fértil masculino, sendo estas varicocele e fragmentação do DNA dos espermatozoides. Métodos: Esta tese foi dividida em 2 capítulos, onde o primeiro visa identificar alterações moleculares no meio extracelular de homens com varicocele. Este capítulo foi dividido em 2 artigos. No artigo I verificou-se: (i) o efeito da varicocele; e (ii) efeito da varicocelectomia nos níveis da proteína Cysteine rich secretory protein 3 (CRISP-3) no plasma seminal, por meio de western blotting. No artigo II, a expressão de microRNAs presentes em vesículas extracelulares do plasma seminal em homens com varicocele, e pré e pós-varicocelectomia foi avaliada utilizando-se microarray. Já o segundo capítulo buscou melhor compreender se o meio extracelular e sua interação com os espermatozoides refletem o status de fragmentação de DNA dos espermatozoides. O primeiro artigo avaliou, a partir de um ensaio Multiplex, a expressão de proteínas da família das Matrix metalloproteinases (MMPs) e seus inibidores Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) no plasma seminal de homens com alta e baixa fragmentação de DNA dos espermatozoides. O segundo artigo verificou a presença da proteína Epididymal sperm-binding protein 1 (ELSPBP1) em amostras de plasma seminal e espermatozoides com alta e baixa fragmentação de DNA por western blotting, além de identificar sua localização nos espermatozoides por imunocitoquímica e, verificar se essa proteína é capaz de separar os espermatozoides com altos níveis de fragmentação de DNA da população saudável, utilizando-se a separação imunomagnética de células. Resultados: Com relação ao estudo da varicocele (capítulo I), no artigo I verificou-se que homens com varicocele apresentam níveis seminais mais elevados de CRISP-3 quando comparado aos controles. Os níveis de CRISP-3 diminuíram após a varicocelectomia. No artigo II, observou-se que existem microRNAs presentes das vesículas extracelulares do plasma seminal que refletem o processo patogênico da varicocele, antes da varicocelectomia. Enquanto que outros microRNAs são envolvidos aos processos protetores da fertilidade. No capítulo II, no qual se estudou a patologia da fragmentação de DNA dos espermatozoides, no artigo I, menores níveis de MMP-2, MMP-7, TIMP-1, TIMP-2 e TIMP-4 no plasma seminal foram observados no grupo alta quando comparados ao grupo baixa fragmentação de DNA dos espermatozoides. Na análise de regressão logística, as proteínas MMP-2, MMP-7 e TIMP-4 classificaram as amostras como baixa e alta fragmentação de DNA. Com relação ao artigo II, a proteína ELSPBP1 está mais expressa nos espermatozoides de amostras com maior média de fragmentação de DNA dos espermatozoides quando comparados as amostras com menor média. Essa proteína, nos espermatozoides humanos está localizada preferencialmente na região da cabeça e, se mostrou eficiente para separar os espermatozoides com maiores níveis de fragmentação de DNA da amostra. Conclusão: O meio extracelular, e sua interação com os espermatozoides estão relacionados com a varicocele e com a fragmentação de DNA dos espermatozoides.

Espermatozoides;Fragmentação de DNA;Plasma seminal;Proteínas;Varicocele
Objective: To evaluate whether the extracellular environment and its interaction with sperm are related to the two main described causes of alteration in male fertile potential, namely varicocele and sperm DNA fragmentation. Methods: This thesis was divided into 2 chapters, where the first one aims to identify molecular changes in the extracellular environment of men with varicocele. This chapter has been divided into 2 articles. In article I it was verified: (i) the effect of varicocele; and (ii) effect of varicocelectomy on the levels of cysteine rich secretory protein 3 (CRISP-3) in seminal plasma by western blotting. In article II, the expression of microRNAs present in seminal plasma extracellular vesicles in men with varicocele, and before and after varicocelectomy was evaluated using microarray. The second chapter sought to better understand whether the extracellular environment and its interaction with sperm reflect the sperm DNA fragmentation status. The first article evaluated, using a Multiplex assay, the expression of proteins from the Matrix metalloproteinases (MMPs) family and their inhibitors named Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) in seminal plasma of men with high and low sperm DNA fragmentation. The second article verified the presence of Epididymal sperm-binding protein 1 (ELSPBP1) in seminal plasma samples and sperm with high and low DNA fragmentation by western blotting and identified its location in the sperm by immunocytochemistry and verified if this protein is capable of separating sperm with high levels of DNA fragmentation from the healthy population, using immunomagnetic cell separation. Results: Regarding the study of varicocele (chapter I), in article I it was found that men with varicocele have higher CRISP-3 seminal levels when compared to controls. CRISP-3 levels decreased after varicocelectomy. In Article II, it was observed that there are microRNAs present in seminal plasma extracellular vesicles that reflect the pathogenic process of varicocele before varicocelectomy. While other microRNAs are involved in fertility protective processes. In Chapter II, which studied the pathology of sperm DNA fragmentation, in article I, lower levels of seminal plasma MMP-2, MMP-7, TIMP-1, TIMP-2 and TIMP-4 were observed in high when compared to the low sperm DNA fragmentation group. In logistic regression analysis, proteins MMP-2, MMP-7 and TIMP-4 classified the samples as low and high DNA fragmentation. With respect to article II, the protein ELSPBP1 is more expressed in sperm from samples with higher levels of sperm DNA fragmentation when compared to samples with lower levels of DNA fragmentation. This protein, in human sperm is preferentially located in the region of the head and was efficient to separate sperm with higher levels of DNA fragmentation from the health population. Conclusion: The extracellular environment and its interaction with sperm are related to varicocele and sperm DNA fragmentation.
DNA fragmentation;Proteins;Seminal plasma;Spermatozoa;Varicocele
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

REPRODUÇÃO HUMANA E ANDROLOGIA
MECANISMOS CELULARES E MOLECULARES DA INFERTILIDADE MASCULINA
Biologia de sistemas e qualidade funcional dos espermatozoides no estudo da infertilidade masculina.

Banca Examinadora

RICARDO PIMENTA BERTOLLA
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
RICARDO PIMENTA BERTOLLA Docente - PERMANENTE
FELIPE PERECIN Participante Externo
LUIZ FRANCISCO CINTRA BACCARO Participante Externo
ALBERTO AZOUBEL ANTUNES Participante Externo
VALTER LUIZ MACIEL JUNIOR Pós-Doc

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SAO PAULO - Bolsa de Doutorado 28
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Demanda Social 2

Vínculo

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Ensino e Pesquisa
Sim