O aumento da população humana mundial reflete diretamente na demanda por alimentos, com destaque a produção e o consumo de peixe, importante fonte de proteína de alto valor nutricional e excelente quantidade e qualidade de vitaminas e minerais. O Brasil é o maior mercado da América Latina com grande e importante potencial de exploração econômica devido a grande variedade de peixes nativos e não nativos. Por isso, potencializar a produção de peixes através de ferramentas que gerem informações relevantes deve ser buscado. Marcadores moleculares microssatélites são importantes ferramentas para a obtenção de informações genéticas, que visam analisar a variabilidade genética de populações e estoques de peixes. Marcadores citogenéticos auxiliam na identificação de espécies e melhor conhecimento cariotípico, facilitando o aprimoramento de cultivo de espécies. Brycon falcatus tem grande importância socioeconômica e biológica no Brasil, porém, o conhecimento genético da espécie ainda é escasso. Oreochromis niloticus é destaque na produção aquícola mundial e brasileira, principalmente devido ao emprego e desenvolvimento de programas de melhoramento genético. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a transferibilidade de primers heterólogos para Brycon falcatus, e analisar citogeneticamente Oreochromis niloticus variedade Tilamax. Foram avaliados 28 primers heterólogos aplicados em 22 indivíduos de Brycon falcatus amostrados ao longo do Rio Araguaia no Estado do Mato Grosso, a partir de fragmentos de nadadeira caudal (0,5 cm2 aproximadamente). Análise de amostras de sangue de 40 indivíduos de Oreochromis niloticus (16 indivíduos da geração de reprodutores (G7), 10 indivíduos da geração subsequente (G8) e 14 indivíduos comerciais (plantel comercial – PC)), provenientes da Estação de Piscicultura Codapar/UEM, no estado do Paraná, também foram analisadas. Primers heterólogos de sete espécies diferentes apresentaram resultados satisfatórios de amplificação cruzada com B. falcatus BoM5 (B. opalinus); Bh8, Bh13 e Bh16 (B. hilarii); Borg59 (Brycon orbignyanus); Par80 (Prochilodus argenteus) e Cm1A8 (Colossoma macropomum). Primers com ausência de amplificação, inespecificidade ou monomorfismo, foram excluídos das análises. Os parâmetros genéticos e o PIC (Conteúdo de informação polimórfica) demonstraram a viabilidade na utilização dos primers para análises genéticas populacionais. Os resultados validaram a utilização de primers de diferentes espécies e gêneros em B. falcatus, o que viabilizará a realização de futuros estudos genéticos nessa espécie, colaborando para melhor entendimento de amplificação cruzada ou até o desenvolvimento de futura amplificação específica. Em Oreochromis niloticus os resultados revelaram que as gerações (G7 e G8) e o plantel comercial (PC) apresentaram número diplóide (2n) igual 44, as regiões organizadoras de nucléolos pela impregnação de nitrato de prata (AgRONs) foram evidenciadas em até quatro cromossomos e a hibridização fluorescente in situ, com sonda de DNAr 18S, detectou sinais em 5 cromossomos, localizados em posição terminal do braço curto. A heterocromatina, pela técnica de banda C, teve ampla distribuição em regiões centroméricas, ricas em pares de base CG (citosina e guanina). Os resultados do presente estudo coincidem com os dados disponíveis na literatura e não apresentaram diferenças quanto às avaliações citogenéticas. Não foram observadas alterações nas características cromossômicas das gerações e o plantel comercial analisados de Oreochromis niloticus (variedade Tilamax).