Objetivos: Desenvolver a técnica cirúrgica, avaliar a segurança e a sobrevivência do
transplante de células do epitélio pigmentado da retina derivadas de células-tronco
embrionárias humanas (hESC-RPE) semeado em um substrato de parylene C no
espaço sub-retiniano de animais de grande porte (Yucatan minipigs). Métodos: Filmes
ultrafinos de parylene C, semeados com hESC-RPE, foram implantados
cirurgicamente no espaço sub-retiniano dos Yucatan minipigs, dando origem a quatro
estudos publicados. No primeiro estudo, a viabilidade do procedimento cirúrgico, a
primeira versão do injetor tecidual, o correto posicionamento do implante, a
compatibilidade de suas dimensões e o dano aos tecidos oculares foram analisados
por meio de estudos de histologia e de imagens de tomografia de coerência óptica de
domínio espectral (SD-OCT) em animais imunossuprimidos (n=8) sacrificados após
três meses da implantação. Foi realizada análise imuno-histoquímica para avaliar a
expressão de anticorpos TRA-1-85 (human blood group antigen) e DAPI. No segundo
estudo, reportou-se a evolução do injetor tecidual e das dimensões do implante
adequado ao uso no estudo clínico. Foram realizadas imagens imediatamente após o
procedimento cirúrgico (Infrared e SD-OCT) para a avaliação in vivo das células
implantadas (n=12). Os animais foram sacrificados imediatamente, e os tecidos,
enviados para análise histológica e imuno-histoquímica para avaliar se houve dano
aos tecidos oculares ou perda celular sobre o implante. No terceiro estudo, foram
avaliadas a sobrevivência celular e a formação de tumores em animais
imunossuprimidos (n=11), comparando o resultado com o de animais que foram
submetidos ao procedimento cirúrgico sem o implante (controles). Foram utilizadas as
versões finais do injetor e do implante que serão analisadas no estudo clínico. No
quarto estudo, descrevemos os métodos de diferenciação de células embrionárias em
epitélio pigmentado da retina in vitro, com a caracterização das células através de
biomarcadores, estudo realizado inteiramente no Brasil. Resultados: No primeiro
estudo, a monocamada de epitélio pigmentado da retina (EPR), semeada no substrato
de parylene C, mostrou-se imunopositiva para TRA-1-85 e RPE-65 três meses após
a implantação cirúrgica, apresentando a viabilidade celular após esse período sem
eventos adversos. As células não migraram para fora do substrato e não houve
formação de tumores no local nem em tecidos periféricos. Análise dos órgãos não
mostrou evidência de tumores. Alguns animais apresentaram opacidade total de córnea no follow-up devido a ceratite de exposição, o que impossibilitou a realização
de exames de imagem no follow-up. No segundo estudo, as novas modificações do
substrato e do injetor foram avaliadas de forma aguda, e não foram verificadas lesões
aos tecidos oculares relacionadas à manipulação cirúrgica, com perda celular mínima
sobre o substrato. No terceiro estudo, mediante análises de histologia e de imagem
ocular, houve sobrevivência celular pelo período de um mês após a implantação, já
com a utilização dos modelos finais de injetor e substrato. Não houve diferença nos
achados histológicos entre os implantados e os controles; e as células mostraram
marcadores típicos de EPR humanos, TRA-1-85 e RPE-65. No quarto estudo, os
métodos de diferenciação foram descritos em condições cGMP, utilizando-se meios e
condições xeno free. Método demonstrou-se viável, com a colheita de 108 células
após as fases de diferenciação e enriquecimento, com as células exibindo o formato
característico de paralelepípedos e expressando os marcadores celulares e
expressão gênica típica de células de EPR adultas. Conclusão: O procedimento
cirúrgico mostrou-se seguro e reprodutível, com perda celular mínima sobre o
implante, com as primeiras e segundas versões dos injetores e substratos teciduais.
As células hESC-RPE sobreviveram por até três meses no espaço sub-retiniano dos
Yucatan minipigs. O procedimento de diferenciação e enriquecimento in vitro de
produção de hESC-RPE mostrou-se viável e reprodutível em solo nacional.