A leptospirose tem sido alvo de estudos nas últimas décadas, enfermidade que acomete diversas espécies de animais e acarreta aborto nos vários estágios de gestação, natimortos, infertilidade, metrites e retenção de tecidos placentários com consequente redução da produção, produtividade e rentabilidade da exploração. O estado de Rondônia é o maior produtor de leite da região norte e o 7º maior do país. Considerando a deficiência de informações sobre a leptospirose no Estado, este estudo teve como objetivo avaliar a prevalência de Leptospira spp. bem como, identificar fatores associados ao risco da infecção da Leptospira spp. em bovinos de leite do município de Ji-Paraná - RO. Amostras de sangue foram coletadas aleatoriamente de 627 fêmeas leiteiras, oriundas de 63 propriedades pertencentes a seis setores rurais. O diagnóstico da leptospirose foi realizado por meio da soroaglutinação microscópica. Constatou-se que 255 animais possuíam anticorpos anti-leptospira (40,48%, IC95%: 36,64-44,31). Das 63 propriedades estudadas, 57 (90,5%, IC95%: 83,23-97,72) apresentavam pelo menos um animal reagente. Observou maior ocorrência do sorovar Hardjo nas fêmeas bovinas (12,38%, IC95%: 10,03-15,18) e constatou-se como fator predisponente a infecção da doença: a ocorrência de aborto em fêmeas de 36 propriedades estudadas (57,14%), a existência de cães criados livres em 47 propriedades (74,60%) e com acesso ao pasto, a água e aos bovinos, bem como, a falta de assistência Médico Veterinária em 33 propriedades (52,38%), reforçando a necessidade de adoção de medidas profiláticas e a conscientização dos produtores rurais sobre a importância e os prejuízos que podem ser causados pela leptospirose.