Introdução: A infecção de corrente sanguínea relacionada a cateter central é complicação frequente em crianças submetidas a transplante de medula óssea, sendo recomendado como adjuvante no tratamento o emprego de selo com antimicrobiano, como o cloridrato de vancomicina, em associação com heparina sódica. Entretanto, são poucas as evidências quanto à estabilidade dos medicamentos utilizados. Objetivos: Verificar a concentração e a estabilidade de soluções de cloridrato de vancomicina e heparina sódica similares às utilizadas na técnica de selo com antimicrobianos, segundo a influência do tempo e da temperatura. Materiais e Métodos: Pesquisa experimental desenvolvida em condições ambientais controladas. Foram verificados o potencial hidrogeniônico (pH), a osmolalidade e a concentração do cloridrato de vancomicina (500 mg), solução fisiológica (SF) e heparina sódica (5.000 U.I.) isoladamente e em associação, resultando em 282 análises. A concentração foi medida por meio de cromatografia líquida de alta eficiência, sendo o método validado seguindo as diretrizes recomendadas para parâmetros de seletividade, linearidade, precisão e exatidão. O cloridrato de vancomicina foi reconstituído em água destilada (AD), diluído em SF e associado a heparina sódica, resultando em concentração de 5 mg/mL do antimicrobiano e 100 U.I./mL do anticoagulante. As soluções foram acondicionadas em frascos de vidro âmbar, em temperaturas de 22° C e 37° C e as análises realizadas no momento inicial (T0), três (T3), oito (T8) e 24 horas (T24) após o preparo. Os dados foram analisados segundo média e desvio padrão, e empregados os testes One-Way ANOVA, Kolmogorov-Smirnov, com correção de Bonferroni (p≤0,05). Resultados: A análise descritiva de pH e osmolalidade das soluções evidenciou variação sem diferença estatisticamente significante, com exceção da osmolalidade da SF (p=0,022). Os valores de pH das soluções de cloridrato de vancomicina diluído, bem como em associação com heparina sódica, a 22º C, apresentaram variação estatisticamente significante (p<0,001). As soluções do antimicrobiano diluído e a 37º C resultaram em pH de 3,73 (±0,02) em T0 a 3,68 (±0,02) em T24 (p=0,004), e na associação obtiveram-se médias de 3,80 (±0,02) em T0 a 3,78 (±0,01) em T24 (p=0,389). A concentração do cloridrato de vancomicina diluído e a 22º C resultou em 5,10 (±0,08) em T0 a 5,12 (±0,07) mg/mL em T24 (p<0,001); e associado a heparina sódica, de 5,09 (±0,19) em T0 a 4,82 (±0,08) mg/mL em T24 (p<0,001). As soluções do antimicrobiano diluído e a 37º C resultaram em concentração de 4,89 (±0,03) em T0 a 4,92 (±0,14) mg/mL em T24 (p<0,001); a associação dos fármacos em 4,75 (±0,09) em T0 a 4,85 (±0,06) mg/mL em T24 (p=0,001). Por meio da análise do aspecto físico das soluções contendo cloridrato de vancomicina e heparina sódica, verificou-se formação de precipitado em T3, tanto a 22º C como a 37º C. Conclusão: O cloridrato de vancomicina apresentou alterações significantes nas situações experimentais estudadas, entretanto, a variação da concentração foi inferior a 10% em todas as situações experimentais. A associação do antimicrobiano com o anticoagulante resultou em estabilidade farmacêutica, porém com incompatibilidade física.