SOUZA, A. P. Transferência gênica de fibroblastos, oócitos e embriões suínos mediada por polietilenoimina. 2019. 87p. Tese (Doutorado em Ciência Animal. Área: Produção Animal) – Universidade do Estado de Santa Catarina. Programa de Pós-graduação em Ciência Animal, Lages, 2019.
Diferentes metodologias são utilizadas para produzir suínos transgênicos, entre elas estão microinjeção pronuclear, transferência gênica mediada por espermatozoide, microinjeção de vetores retrovirais em oócitos, transferência nuclear de células somáticas previamente modificadas. Todos esses métodos foram capazes de produzir com sucesso suínos transgênicos. Porém, ainda apresentam limitações, como a baixa integração do transgene e baixo percentual de animais produzidos, ainda, algumas são caras e laboriosas. Assim, torna-se relevante o desenvolvimento de métodos e padronizações que aumentem a eficiência e melhorem a relação custo-benefício da produção de suínos geneticamente modificados. A Polietilenoimina (PEI) é um polímero catiônico, que condensa o DNA em partículas carregadas positivamente, formando complexos que se ligam aos resíduos de superfície aniônicos e são levados para dentro da célula por endocitose. Tem-se descrito o uso da PEI como um bom agente transfectante numa ampla gama de tipos celulares, apesar disso, até o momento não há um protocolo desenvolvido para este polímero visando a transfecção de células na espécie suína. Diante disto, o objetivo do presente trabalho desenvolver protocolos de transfecção celular eficiente para fibroblastos fetais, oócitos e embriões suínos. Para isso, o presente trabalho foi realizado em duas etapas. A etapa I consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para fibroblastos fetais suínos (FFS). Para isso foram conduzidos 3 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (0,625; 1,25; 2,5; 5; 10; 20; 40 e 80μg/mL) por incubação em diferentes períodos (0,5, 1 e 2 horas). O experimento 2 foi realizado para determinar a melhor razão polímero/eDNA, sendo o grau de complexação avaliado por eletroforese em gel de agarose. No experimento 3, a transfecção foi realizada baseada nos resultados dos experimentos anteriores. Para a transfecção, foram utilizadas as concentrações 10 e 40μg/mL, a razão N/P igual a 2, por um período de incubação de 0,5h. Não foi verificada diferença entre as concentrações de PEI utilizadas na porcentagem de células positivas para GFP, no entanto, a concentração de 40μg/mL causou maiores danos as células transfectadas. Além disso, a GFP foi expressa por um período de 3 dias, o que sugere que o plasmídeo atingiu o núcleo dos fibroblastos, tendo o gene sido expresso de forma não transiente. A etapa II, consistiu no desenvolvimento de um protocolo para de transfecção gênica para oócitos e embriões suínos. Nesta etapa foram conduzidos 2 experimentos. No experimento 1 foi avaliada a capacidade da PEI de ser internalizada em diferentes concentrações (10; 20; 40 e 80μg/mL). No experimento 2, baseado nos resultados do experimento 1, as transfecções foram realizadas utilizando as concentrações 20 e 80μg/mL, a razão de PEI/ eDNA igual a 2, por 0,5h de incubação. Nesta etapa foi demostrado que a PEI, diferente de outros agentes transfectantes, tem a capacidade de passar a zona pelúcida, sendo o protocolo desenvolvido foi capaz de produzir blastocistos transgênicos para GFP, tanto de oócitos e embriões transfectados. Os resultados apresentados neste trabalho mostram que através da transfecção gênica mediada pela polietilenoimina foi possível gerar fibroblastos e blastocistos suínos transgênicos para proteína verde fluorescente de forma eficiente.