Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA ( AREIA )
ZOOTECNIA (25003011009P0)
Rizóbios isolados de leguminosas forrageiras do semiárido: Biodiversidade e Eficiência Simbiótica
SUELANE DE MELO DIAS
TESE
06/04/2018

A fixação biológica de nitrogênio é um processo natural que ocorre entre associações de plantas e bactérias diazotróficas. A maioria das fabáceas forrageiras encontradas na Caatinga possuem alto valor econômico, podendo ser usadas para aumentar o aporte de nitrogênio e matéria orgânica no solo, através da fixação biológica de nitrogênio e ciclagem de nutrientes. Assim o objetivo deste trabalho foi caracterizar morfofisiologicamente isolados de rizóbios nativos das espécies forrageiras Desmanthus pernambucanus (L.) Thellung., Mimosa caesalpiniifolia Benth. e Mimosa tenuiflora (Wild) Poir. Avaliar a resistência ao estresse salino, acidez, toxidade por alumínio e capacidade de solubilização do fosfato de cálcio in vitro, bem como testar a aficiencia simbiótica dos isolados. Autenticar os isolados de rizóbios nativos através da amplificação simultânea de fragmentos dos genes nifH e nodC por meio da técnica duplex PCR. Determinar a diversidade genética dos isolados pela técnica de análise de restrição do DNA ribossomal amplificado (PCR-RFLP) utilizando as endonucleases HhaI, MspI e HinfI e quantificar a produção de compostos indólicos in vitro. O solo usado como substrato para o cultivo das fabáceas foi coletado em pontos específicos dos municípios de Boa Vista, São Sebastião de Lagoa de Roça e Pocinhos no estado da Paraíba. Os nódulos foram obtidos do cultivo de planta isca em casa de vegetação. As bactérias, provenientes dos nódulos, foram isoladas e purificadas em laboratório e após o protocolo de isolamento as bactérias foram avaliadas culturalmente e submetidas aos testes de: Tolerância ao baixo pH + Al3+, diferentes meios salinos e solubilização do fosfato de cálcio in vitro. Em seguida foi realizado um experimento para a avaliação da enficiencia simbiótica dos isolados, inoculados em Vigna unguigulata (L.) Walp. sob condições estéries em casa de vegetação. Após o isolamento e purificação dos isolados, o DNA bacteriano foi extraído e submetido à amplificação dos fragmentos dos genes simbióticos nifH e nodC para posterior avaliação da diversidade genética acessada por PCR-RFLP. Para tal, o gene 16S rRNA foi amplificado, empregando os iniciadores universais 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) e 1492R (TACGGYTACCTTGT TACGACTT). As reações de restrição foram realizadas utilizando as endonucleases HhaI, MspI e HinfI. O produto da digestão foi submetido à eletroforese horizontal em gel de agarose a 3%, em tampão TAE 1% por 80 min a 100 Volts. Para a quantificação dos Compostos Indólicos foi utilizado o método colorimétrico na avaliação das colônias acrescidas com L-triptofano (3,5 mg) e sem L-triptofano em meio de cultira YM. Todos os isolados foram avaliados como bactérias acidificantes de crescimento rápido com principais características morfológicas de colônias irregulares com elevação umbiculada, superfície lisa e produção de exopolissacarídeos moderada. Os isolados DPBV41 e DPBV53 não tiveram crescimento visível, na placa de petri, quando submetidos a um pH 4,5 com e sem alumínio, caracterizando-se como isolados não tolerantes. Os isolados mais afetados pela variação do pH do meio de cultura e toxidade por alumínio foram as bactérias isoladas da fabácea Desmanthus pernambucanus. As colônias de rizóbios que tiveram maiores probabilidades de tolerar os meios de cultura com alto teor de salinidade foram: MTBV77, MTP72, MTP37, DPBV42 e DPBV53 com crescimento máximo em todas as zonas de repicagem da placa de petri. Nas xv avaliações de amplificação simultânea dos genes simbióticos, dentre os 80 isolados de rizóbios testados, 16 amplificaram apenas o gene nifH e cinco isolados amplificaram ambos os genes nifH+nodC simultaneamente. O padrão de bandeamento dos 21 isolados de rizóbios variou de acordo com cada enzima de restrição (HinfI, HhaI e MspI) e resultou em diferentes perfis de restrição transformados em dados binários e avaliados através de matriz de dissimilaridade genética pelo complemento do coeficiente de Jaccard. A partir da matriz de dissimilaridade foi construído um dendrograma pelo método de Ward, com o número de grupos definido pelo método de Mojena, resultando em IV grupos. Em média, a distância entre os pares de genótipos foi de 0,56. Destacaram-se como os pares mais divergentes os isolados DPP1 e MTP44, com distancia de 0,89 e os mais similares MTP72 e MTBV77 com distância de 0,10. A produção de Compostos Indólicos foi maior nas amostras onde houve acréscimo de L-triptofano, precursor do ácido-indol-acético, pelas bactérias MTBV12, MTBV77, MTP78 e MTP37. Os isolados de rizóbios nativos, avaliados nesse estudo, tem alta diversidade genética e se agrupam com base na planta isca da qual são isolados. A produção de Compostos indólicos é variável entre os isolados selecionados e é potencializada na presença do precursor L-Triptofano. Os isolados nativos de Mimosa tenuiflora são mais tolerantes ao estresse salino, acidez, e toxidade por alumínio, em comparação as demais bactérias nativas isoladas de Desmanthus pernambucanus e Mimosa caesalpinifollia. A maioria dos isolados de rizóbios nativos, avaliados neste trabalho, tem baixa capacidade de solubilização do complexo fosfato de cálcio. Todas as bactérias isoladas foram capazes de nodular a espécie Vigna unguigulata.

Caatinga, Diversidade microbiana, Fabáceas nativas,
Biological nitrogen fixation is a natural process that occurs in associations of plants with diazotrophic bacteria. Most of the fodder fabaceae found in the Caatinga have high economic value and can be used to increase the nitrogen and organic matter input in the soil through biological nitrogen fixation and nutrient cycling. Thus the objective of this work was to characterize morphophysiologically isolated of rhizobia native to the forage species Desmanthus pernambucanus (L.) Thellung., Mimosa caesalpiniifolia Benth. and Mimosa tenuiflora (Wild) Poir. To evaluate the resistance to saline stress, acidity, aluminum toxicity and solubilization capacity of calcium phosphate, as well as to test the symbiotic affectivity of the isolates. Authenticate the native rhizobia isolates through the simultaneous amplification of fragments of the nifH and nodC genes by means of the duplex PCR technique. To determine the genetic diversity of the isolates by the amplified ribosomal ADN restriction analysis (PCR-RFLP) technique using the HhaI, MspI and HinfI endonucleases and quantify the production of in vitro indole compounds. The soil used as substrate for the cultivation of the fabaceae was collected at specific points in the municipalities of Pocinhos, São Sebastião de Lagoa de Roça and Boa Vista in the state of Paraíba. The nodules were obtained from the cultivation of a bait plant in a greenhouse. Bacteria from the nodules were isolated and purified in the laboratory and after the isolation protocol the bacteria were culturally evaluated and submitted to the tests of: Tolerance to low pH + Al3+, different saline media and solubilization of calcium phosphate in vitro. An experiment was then carried out to evaluate the symbiotic efficiency of the isolates inoculated in Vigna unguigulata (L.) Walp. under sterile conditions in a greenhouse. After isolation and purification of the isolates, ADN was extracted and subjected to the amplification of the fragments of symbiotic genes nifH and nodC for further evaluation of the genetic diversity accessed by PCR-RFLP. For this, the 16S rRNA gene was amplified using the 27F universal primers (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG) and 1492R (TACGGYTACCTTGT TACGACTT). Restriction reactions were performed using the HhaI, MspI and HinfI endonucleases. The digestion product was subjected to horizontal electrophoresis in 3% agarose gel in 1% TAE buffer for 80 min at 100 Volts. For the quantification of Indolic Compounds, the colorimetric method was used to evaluate the colonies added with L-tryptophan (3.5 mg) and without L-tryptophan in YM culture medium. All isolates were evaluated as fast growing acidifying bacteria with the main morphological characteristics of irregular colonies with umbiculate elevation, smooth surface and moderate exopolysaccharide production. The DPBV41 and DPBV53 isolates did not show visible growth in the petri dish when submitted to pH 4.5 with and without aluminum, characterizing as non-tolerant isolates. The isolates most affected by the pH variation of the culture medium and aluminum toxicity were the bacteria isolated from the Desmanthus pernambucanus. The rhizobia colonies that were most likely to tolerate high salinity culture media were: MTBV77, MTP72, MTP37, DPBV42 and DPBV53 with maximum growth in all of the petri dishes. In the simultaneous amplification evaluations of symbiotic genes, among the 80 rhizobia isolates tested, 16 amplified only the nifH gene and five isolates amplified both nifH + nodC genes simultaneously. The xvii genetic variability of the 21 rhizobia isolates varied according to each restriction enzyme (HinfI, HhaI and MspI) and resulted in different restriction profiles transformed into binary data and evaluated through genetic dissimilarity matrix by the complement of the Jaccard coefficient. From the dissimilarity matrix a dendrogram was constructed by the Ward method, with the number of groups defined by the Mojena method, resulting in IV groups. On average, the distance between pairs of genotypes was 0.56. The most divergent pairs were the DPP1 and MTP44 isolates, with a distance of 0.89 and the most similar MTP72 and MTBV77 with a distance of 0.10. The production of Indole Compounds was higher in the samples where there was an increase of L-tryptophan, precursor of indole-acetic acid, by bacteria MTBV12, MTBV77, MTP78 and MTP37. The isolates of native rhizobia have high genetic diversity and are grouped based on the bait plant from which they are isolated. The production of Indole Compounds is variable among the selected isolates and is potentiated in the presence of the L-Tryptophan precursor. The native isolates of Mimosa tenuiflora are more tolerant to saline stress, acidity, and aluminum toxicity compared to other native bacteria isolated from Desmanthus pernambucanus and Mimosa caesalpinifollia. Most of the native rhizobia isolates, evaluated in this work, have low solubilization capacity of the calcium phosphate complex. All the bacteria isolated were able to nodulate the species Vigna unguigulata.
Caatinga, Microbial diversity, Native fabaceae, Nitrogen.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA ( AREIA )
O trabalho possui divulgação autorizada

Contexto

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Banca Examinadora

ALBERICIO PEREIRA DE ANDRADE
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
MERCIA VIRGINIA FERREIRA DOS SANTOS Docente - PERMANENTE
RINALDO LUIZ CARACIOLO FERREIRA Participante Externo
MAILSON MONTEIRO DO REGO Participante Externo
RISELANE DE LUCENA ALCANTARA BRUNO Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Demanda Social 36

Vínculo

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Não