Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
CIÊNCIA ANIMAL (40002012009P7)
ASPECTOS MOLECULARES DE OÓCITOS DE FÊMEAS BOS INDICUS E BOS TAURUS SUBMETIDOS AO ESTRESSE TÉRMICO
MIRELA BROCHADO SOUZA CACERES
TESE
11/05/2018

Com o objetivo de avaliar a influência do estresse térmico sobre a competência oocitária, bem como sobre parâmetros fisiológicos de fêmeas bovinas de diferentes raças, foram realizados três experimentos. No experimento I, foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de vacas da raça Simental maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C ou 40°C). Antes da maturação, os oócitos foram corados com Brilhante Cresilblue (BCB) e, classificados em BCB+ e BCB-. Os COCs marcados (BCB+) eram considerados de melhor qualidade. Após a maturação, foram produzidos embriões in vitro e os oócitos foram avaliados através de PCR em tempo real e imunofluorescência, para avaliação das sirtuínas, BCL11A e p53. A alteração da temperatura (±1,5°C) de maturação do oócito afetou negativamente a taxa de blastocisto após a fertilização in vitro, além de influenciar a expressão de gene importantes para a proteção celular. A expressão dos genes SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5, BCL11a e p53 foi alterada pela temperatura de maturação, em oócitos e células da granulosa. No experimento II foram avaliados complexo cumulus-oócitos (COCs) de fêmeas da raça Nelore (Bos Taurus indicus) maturados in vitro em diferentes temperaturas (37°C, 38,5°C e 40°C). Após esse período parte dos COCs foram submetidos a fecundação e cultivo dos embriões e a outra parte, após determinação da taxa de maturação, foram fixados em paraformoldeído para análise de HSP70 e HSP90 por western blott. O estresse térmico não influenciou a taxa de maturação nuclear dos oócitos, porém influenciou a taxa de clivagem e de blastocisto. A intensidade do sinal da HSP70 foi aumentado nos oócitos submetidos a estresse, em relação ao grupo controle, além disso as células cumulus mostraram um aumento significativo da intensidade de sinal dessa proteína à 40°C. A HSP90 mostrou maior quantidade em oócitos maturados à 37°C, porém se mantendo estável nas demais temperaturas. A menor taxa de blastocistos e a ação paralela das HSP´s demonstram que a produção in vitro de embriões é afetada quando a maturação in vitro ocorre em situações de estresse crônico (24 hs de MIV; 37°C e 40°C). E no experimento III foram avaliados complexos oócitos-cumulus (COCs) recuperados através da aspiração folicular guiada por ultrassonografia (OPU), de vacas Bos taurus x Bos indicus (Girolando) e Bos taurus (Pantaneira). Parte dos COCs viáveis foram submetidos a análise de imunofluorescência sob microscopia confocal para identificação das proteínas HSP70 e HSP90. Antes da realização de cada OPU, foi aferida a temperatura retal (TR) e frequência respiratória (FR) de cada animal. O estresse térmico foi estimado pelo Indice de Temperatura do Globo e Umidade (ITGU) que foi calculado de acordo com a fórmula descrita por Buffington et al. (1981) e classificados de acordo com o National Weather Service, 90 dias antes de cada OPU. A rusticidade das raças Girolando e Pantaneira pode ser confirmada pela manutenção da TR e FR em nívies fisiológicos em ITGUs de até 94. A HSP nos oócitos foi influenciada pelo ITGUs para as duas raças, porem com comportamentos contrários. No entanto, a raça Pantaneira sofreu efeitos negativos em ITGUs <78 demonstrando estresse em temperaturas mais amenas. Por outro lado, observa-se que ITGUs >78 apresentam efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando. Aparentemente a raça Pantaneira reage negativamente em temperaturas mais baixas, já que apresentou menor viabilidade oocitária com ITGUs <78. Por outro lado observa-se que ITGUs de >79 aos 90 dias antes da OPU apresentam um efeito deletério na qualidade do oócitos de vacas Girolando.

Girolando;Heat Shock protein (HSP);ITGU;Nelore;Pantaneira;Simmental;Sirtuínas;viabilidade oocitária
Aiming to evaluate the effects of in vivo and in vitro thermal stress on oocyte competence and early embryonic development as well as on physiological parameters of cows of different breeds, they were conducted three experiments. In the experiment I, the cumulus-oocyte complex (COCs) of Simmental cows matured in vitro at different temperatures (37°C, 38.5°C and 40°C) were evaluated. Before maturation the oocytes were stained with Brilliant Cresilblue (BCB) and then categorized according to staining in BCB + and BCB-. The labeled COCs (BCB +) were considered to be of better quality. After maturation, embryos were produced in vitro and oocytes were evaluated by realtime PCR and immunofluorescence, for the evaluation of sirtuins, BCL11A and p53. The change in temperature (±1,5°C) of oocyte maturation adversely affects the blastocyst rate after in vitro fertilization, in addition to influencing gene expression important for cell protection. Expression of the SIRT1, SIRT2, SIRT3, SIRT5, BCL11a and p53 genes were influenced by the maturation temperature in oocytes and granulosa cells. In the experiment II, cumulus-oocyte complexes (COCs) of Nellore (Bos Taurus indicus) females were evaluated in vitro at different temperatures (37°C, 38,5°C and 40°C). After this period part of the COCs were submitted to embryo fertilization and culture and the other part, after determining the maturation rate, were fixed in paraformoldeído for analysis of HSP70 and HSP90 by western blot. Thermal stress did not influence the maturation rate of oocytes, but influenced the rate of cleavage and blastocyst. The signal intensity of HSP70 was increased in stressed oocytes compared to the control group, and cumulus cells showed a significant increase in the signal intensity of this protein at 40°C. HSP90 showed higher numbers in oocytes matured at 37 ° C, but remained stable in the other temperatures. The lower rate of blastocysts and the parallel action of HSPs demonstrate that the in vitro production of embryos is affected when in vitro maturation occurs in situations of chronic stress (24 hours of IVM) by cold and heat. In the experiment III, cumulative oocytes (COCs) recovered through ultrasound-guided follicular aspiration (OPU), Bos taurus x Bos indicus (Girolando) and Bos taurus (Pantaneira) cows were evaluated. Part of the viable COCs were submitted to immunofluorescence analysis under confocal microscopy for identification of HSP70 and HSP90 proteins. Before each OPU, the rectal temperature (RT) and respiratory frequency (RF) of each animal were measured. Thermal stress was estimated by the Black Globe Humidity Index (BGHI) which was calculated according to the formula described by Buffington et al. (1981) classified according to the National Weather Service, 90 days before each OPU. The rusticity of the Girolando and Pantaneira breeds can be confirmed by the maintenance of the RT and RF in physiological levels in BGHIs of up to 94. The HSP in the oocytes was influenced by the BGHIs for both breeds, but with opposite behaviors. However, the Pantaneira breed had negative effects on BGHIs <78 demonstrating stress at warmer temperatures. On the other hand, it is observed that BGHIs >78 have a deleterious effect on the quality of Girolando cow oocytes. It appears that the Pantaneira breed reacts negatively at lower temperatures, since it presented lower oocyte viability with BGHI <78. On the other hand it is observed that ITGUs of> 79 at 90 days before OPU have a deleterious effect on the quality of Girolando cow oocytes.
BGHI;Girolando;Heat stress;HSP;Immunofluorescence;Nelore;oocyte viability;Simmental;Sirtuins
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA
O trabalho possui divulgação autorizada

Contexto

PRODUÇÃO ANIMAL
1.BIOTÉCNICAS APLICADAS À REPRODUÇÃO ANIMAL.
EPIGENÉTICA APLICADA A FOLICULOGENESE

Banca Examinadora

MARIA ISABEL MELLO MARTINS
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
FABIANA DE ANDRADE MELO STERZA Participante Externo
KATIA CRISTINA SILVA SANTOS Participante Externo
MARGOT ALVES NUNES DODE Participante Externo
THALES RICARDO RIGO BARREIROS Participante Externo
MARCELO MARCONDES SENEDA Docente - PERMANENTE

Vínculo

CLT
Empresa Privada
Não