O uso de células tronco mesenquimais (CTMs) tem sido vastamente investigado para o tratamento de doenças musculoesqueléticas em equinos, principalmente, devido às injúrias sofridas durante a atividade física intensa. É conhecido também que para o sucesso do procedimento, é necessária uma grande quantidade de CTMs viáveis, o que pode ser obtido através de um banco de células. Portanto, a criopreservação é um tema de grande interesse na área da terapia celular, pois pode manter a viabilidade de um material biológico por longos períodos de tempo. No entanto, o uso de agentes crioprotetores (CPAs) permeáveis, como o DMSO, nos processos de criopreservação (congelação lenta ou vitrificação) pode causar injúrias, devido sua toxicidade, o que pode ser minimizado, quando usados em baixas concentrações ou associados a ACPs não permeáveis, como os açúcares ou os polímeros sintéticos. Portanto, o objetivo principal deste estudo foi avaliar a viabilidade, capacidade proliferativa e de diferenciação (linhagens osteogênica, condrogênica e adipogênica) das CTMs equinas oriundas do tecido adiposo após a congelação na presença de diferentes soluções compostas por ACPs, permeável (DMSO) e não permeáveis [(Trealose (T) e SuperCool X-1000 (X-1000)]. A combinação desses ACPs, resultou em sete diferentes soluções de congelação (SC): DMSO; T; X-1000; DMSO+T; DMSO+X-1000; T+X-1000 e DMSO+T+X-1000. Inicialmente, as CTMs equinas frescas (controle) ou congeladas nas diferentes SC foram avaliadas quanto à viabilidade. Posteriormente, a unidade formadora de colônia (CFU - proliferação) e a capacidade de diferenciação celular nas linhagens acima mencionadas foram avaliadas, somente nas células frescas ou que apresentaram viabilidade superior a 40%, após congelação/descongelação. Os dados mostraram que a viabilidade pós congelação das CTMs equinas em todas as SC, reduziu significativamente em relação ao controle (100%). No entanto, a viabilidade das CTMs congeladas na presença apenas do DMSO (80.3 ± 0.6) foi superior (P<0.05) à observada nas demais SC. Para a CFU, não houve diferença (P>0.05) entre as células frescas e as congeladas. Independente do tratamento, as CTMs apresentaram potencial de diferenciação nas três linhagens. Porém, apesar da redução significativa na capacidade de diferenciação osteogênica, não houve diferença (P>0.05) entre as SC testadas e o controle. Por outro lado, células congeladas em DMSO+X-1000 reduziram (P<0.05) seu potencial de diferenciação na linhagem condrogênica em relação ao controle, porém, foi semelhante às demais SC (P>0.05). No tocante à diferenciação adipogênica, não houve diferença entre os tratamentos (P>0.05). Em conclusão, esse estudo confirmou o sucesso da congelação de CTMs na presença do DMSO e evidenciou o potencial de utilização do polímero sintético Super Cool X-1000 na congelação de células tronco, abrindo novas perspectivas para investigação do uso desse polímero e o DMSO em diferentes concentrações e combinações.