Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
MEDICINA (NEFROLOGIA) (33009015016P8)
Comparação dos efeitos de células-tronco e de suas vesículas extracelulares no tratamento de lesão renal induzida por estenose crônica da artéria renal
CRYSTHIANE SAVERIANO RUBIAO ANDRE ISHIY
TESE
29/06/2018

A estenose crônica da artéria renal é considerada uma das causas mais frequentes de hipertensão renovascular (HR) podendo levar a injúria irreversível do tecido renal e deterioração da função renal. Neste projeto utilizamos o modelo experimental de estenose parcial da artéria renal conhecida como modelo 2 rins - 1 clipe (2R-1C) para induzir HR e hipóxia renal crônica. Diante das alternativas limitadas de tratamentos e a reduzida habilidade angiogênica e regenerativa dos rins, as células-tronco surgem como uma alternativa promissora de terapia para lesão renal pós-isquemia crônica. Estudos prévios mostraram que células-tronco mesenquimais (MSC) obtidas de medula óssea produziram significantes benefícios no modelo 2R-1C através de efeitos parácrinos, estimulando a angiogênese e a imunomodulação. Evidências recentes indicam que o meio condicionado de MSC contendo vesículas extracelulares (VE), incluindo as microvesículas (MV) e os exossomos (EX) têm efeitos terapêuticos semelhantes às próprias MSC. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar e comparar os efeitos das MSC obtidas de tecido adiposo e suas MV e EX na regeneração tecidual no modelo 2R-1C. Metodologia: As MSC foram obtidas do tecido adiposo branco (ASC) de ratos Wistar e foram caracterizadas de acordo com o seu imunofenótipo e multipotencialidade. As vesículas extracelulares (VE) foram isoladas do meio de cultura das ASC e separadas, de acordo com o tamanho, em MV e EX por ultracentrifugação. As vesículas foram identificadas por rastreamento de nanopartículas (Nanosight) e analisadas pela presença de marcadores específicos para cada tipo de VE por western blotting. Ratos Wistar machos foram divididos em cinco grupos: 1- Grupo Sham; 2- Grupo Estenótico; 3- Grupo Estenótico + ASCs; 4- Grupo Estenótico + MV; 5- Grupo Estenótico + EX. As ASC, MV e EX foram infundidas através da veia caudal na 3ª e 5ª semanas após o clampeamento da artéria renal esquerda. A pressão arterial sistólica (PAS) foi acompanhada semanalmente. Após seis semanas foram coletados urina de 24 horas e sangue para as análises bioquímicas. Os rins foram retirados para análise de biologia molecular. A expressão gênica foi verificada por PCR quantitativo em tempo real analisando os seguintes marcadores: Colágeno I (Col I), TGFβ, HIF-1α SDF-1α, IL-1β e IL-10 no córtex e na medula renal. Resultados: Análise por citometria de fluxo mostrou que após 48 horas as ASCs ficaram retidas principalmente nos rins estenótico e contralateral seguido pelos pulmões e coração. Após 15 dias a presença de ASC diminuiu significantemente nos pulmões, mas ainda estavam presentes em ambos os rins. Os animais estenóticos apresentaram um aumento progressivo da PAS enquanto os grupos tratados com ASC, MV e EX apresentaram uma estabilização da PAS em graus semelhantes entre os diferentes tratamentos. A creatinina plasmática foi similar entre os grupos, entretanto, os animais estenóticos desenvolveram proteinúria a qual foi reduzida pelo tratamento com ASC e MV, mas não com EX. Houve um aumento na expressão de Col I e TGFβ no rim estenótico e contralateral (córtex e medula) o qual foi reduzido pelo tratamento com ASC, MV e EX. Os animais tratados com ASC apresentaram um aumento significante na expressão do marcador de homing de células-tronco SDF1-α no córtex e medula tanto no rim estenótico quanto no rim contralateral, os grupos tratados com MV e EX também apresentaram aumento, embora menor, na expressão de SDF1-α em ambos os rins. O marcador de hipóxia HIF1-α apresentou aumento no rim estenótico e os tratamentos com ASC, MV e EX foram eficientes em reduzir este marcador. Houve um aumento da citocina pró-inflamatória IL-1β em ambos os rins dos animais hipertensos sendo eficientemente reduzida nos dois rins principalmente pelo grupo tratado com ASC e os tratamentos com ASCs, MV e EX foram capazes de induzir um aumento na expressão da citocina anti-inflamatória IL-10. Em conclusão, os resultados sugerem que as VE liberadas por ASC produziram bons resultados, porém com menor eficiência em alguns parâmetros quando comparado às ASC. A utilização das ASC produziu efeitos mais eficazes neste modelo de hipóxia crônica comparados à MV e EX e, portanto, a utilização das VE em substituição às células deve ser avaliada na dependência do parâmetro a ser corrigido.

hipertensão renovascular, doença renal crônica, células-tronco mesenquimais, células-tronco de tecido adiposo, microvesículas, exossomos
Chronic renal artery stenosis is considered one of the most frequent causes of renovascular hypertension (RH), which can lead to irreversible renal tissue damage and deterioration of renal function. In this project we used the experimental model of partial stenosis of the renal artery known as 2 kidneys - 1 clip model (2K-1C) to induce RH and chronic renal hypoxia. Faced with limited treatment alternatives and reduced angiogenic and regenerative ability of the kidneys, stem cells appear as a promising alternative therapy for chronic renal ischemia. Previous studies have shown that mesenchymal stem cells (MSCs) obtained from bone marrow have produced significant beneficial effects on the 2K-1C model through paracrine effects, stimulating angiogenesis and immunomodulation. Recent evidence indicates that MSC conditioned medium containing extracellular vesicles (EV), including microvesicles (MV) and exosomes (EX) released by MSC have therapeutic effects similar to MSCs. Therefore, the aim of this study was to investigate and compare the effects of MSC obtained from adipose tissue and MV and EX on tissue regeneration in the 2K-1C model. Methods: MSCs were obtained from white adipose tissue (ASC) of Wistar rats and were characterized according to their immunophenotype and multipotentiality. Extracellular vesicles (EV) were isolated from the ASC culture medium and size-separated in MV and EX by ultracentrifugation. Vesicles were identified by nanoparticles tracking using Nanosight and analyzed by the presence of specific markers for each type of EV by western blotting. Male Wistar rats were divided into five groups: 1- Sham Group; 2- Stenotic Group; 3- Stenotic Group + ASCs; 4- Stenotic Group + MV; 5- Stenotic Group + EX. The ASC, MV and EX were infused through the tail vein at the 3rd and 5th weeks after clamping. Systolic blood pressure (SBP) was monitored weekly. After six weeks, 24-hour urine and blood were collected for biochemical analyzes. Kidneys were removed for molecular biology analysis. Gene expression was verified by quantitative real-time PCR and analyzed using the following markers: Collagen type I (Col I), TGFβ, HIF-1α SDF-1α, IL-1β and IL-10 in the renal cortex and medulla. Results: Flow cytometry analysis showed that after 48 hours the ASCs were retained mainly in the stenotic and contralateral kidneys followed by lungs and heart. After 15 days the presence of ASC decreased significantly in the lungs but was still present in both kidneys. The stenotic animals showed a progressive increase in SBP while the groups treated with ASC, MV and EX showed a stabilization of PAS in similar degrees between the different treatments. Plasma creatinine was similar between groups, however, the stenotic animals developed proteinuria which was reduced by treatment with ASC and MV an effect not observed in the EX treated group. There was an increase in the expression of Col I and TGFβ in the stenotic and contralateral kidney (cortex and medulla) which was reduced by the treatment with ASC, MV and EX. ASC-treated animals showed a significant increase in expression of the stem cells homing marker (SDF1-α) in the cortex and medulla in the stenotic and contralateral kidney, the MV and EX treated groups also showed an smaller increase in the expression of SDF1-α in both kidneys. The hypoxia marker (HIF1-α) presented an increase in the stenotic kidney and the treatments with ASC, MV and EX were efficient in reducing this marker. There was an increase of the pro-inflammatory cytokine IL-1β in both kidneys of the hypertensive animals being efficiently reduced in both kidneys mainly by the ASC treated group and the treatments with ASCs, MV and EX was able to induce an increase the anti- inflammatory cytokine IL- 10. In conclusion, the results suggest that the EV released by ASC produced good results, but with lower efficiency in some parameters when compared to ASC. The use of ASCs has produced more effective effects in this model of chronic hypoxia and the use of EV in replacement to cells should be evaluated depending on the parameter to be corrected.
renovascular hypertension, chronic kidney disease, mesenchymal stem cells, adipose derived stem cells, microvesicles, exosome.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

NEFROLOGIA EXPERIMENTAL
BIOQUÍMICA, FISIOLOGIA E FISIOPATOLOGIA EXPERIMENTAL
MICRORNAS, VESÍCULAS EXTRACELULARES E CÉLULAS TRONCO: PAPEL FISIOLÓGICO, FISIOPATOLÓGICO E POTENCIALIDADE TERAPÊUTICA EM DOENÇAS RENAIS

Banca Examinadora

MIRIAN APARECIDA BOIM
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
RENATA NAKAMICHI Pós-Doc
FERNANDA TEIXEIRA BORGES Docente - COLABORADOR
WALDEMAR SILVA ALMEIDA Participante Externo
OSWALDO KEITH OKAMOTO Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Excelência Acadêmica 48

Vínculo

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Não