Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
MEDICINA (NEFROLOGIA) (33009015016P8)
Pesquisa de podocitúria: desenvolvimento e padronização de métodos
AMELIA RODRIGUES PEREIRA SABINO
TESE
22/02/2018

Introdução: Os podócitos são células imprescindíveis para a manutenção da funcionalidade da barreira de filtração glomerular, que é caracterizada por ter permeabilidade seletiva. A podocitúria, excreção de podócitos na urina, tem sido estudada em diversas glomerulopatias como um potencial marcador de atividade da doença. A pesquisa de podocitúria é um método não invasivo, que pode refletir em tempo real a lesão causada ao podócito no glomérulo, podendo ser mais sensível e precoce que outros de uso rotineiro. Apresenta aplicabilidade potencial na avaliação de atividade das doenças glomerulares e no entendimento de sua patogênese, bem como poderia orientar intervenções terapêuticas futuras. Objetivos: Padronizar e validar a metodologia para a pesquisa de podocitúria, por meio de duas técnicas, imunofluorescência indireta e quantificação por reação da polimerase em cadeia em tempo real, além de buscar determinar qual a técnica mais adequada para esse fim. Material e Métodos: A pesquisa de podocitúria se deu em um grupo de 71 pessoas, sendo 21 (29,17%) pacientes com glomeruloesclerose segmentar e focal, 20 (27,78%) com nefrite lúpica e 31 (43,06%) indivíduos saudáveis incluídos como controle. Foram utilizadas as técnicas de imunofluorescência indireta e reação da polimerase em cadeia via transcriptase reversa quantificada em tempo real para determinação de RNAm de podocina, proteína específica do podócito. Também foram avaliados níveis séricos de creatinina e relação proteína/creatinina urinária, assim como a ocorrência e intensidade de atividade das doenças com base em parâmetros clínicos e laboratoriais. Resultados: A podocitúria determinada com anticorpos anti-podocina correlaciona-se estatisticamente de forma crescente com a relação proteína/creatinina urinária (p=0,013), além de apresentar uma tendência a se correlacionar de forma crescente com a expressão gênica relativa de RNAm de podocina na urina (p=0,056). O grupo de indivíduos saudáveis apresentou níveis de podocitúria com anti-podocina significantemente menores que o grupo de indivíduos doentes, tanto quando considerados em conjunto, quanto em separado por doença (p=0,001 e p<0,001, respectivamente). O grupo doente apresentou maior expressão gênica relativa que o grupo de indivíduos saudáveis (p=0,047). Quando avaliado cada diagnóstico separadamente, somente nefrite lúpica apresentou maior expressão gênica relativa que o grupo de indivíduos saudáveis (p=0,029). Conclusão: No presente estudo, as técnicas de quantificação de podocitúria por imunofluorescência indireta e por reação da polimerase em cadeia via transcriptase reversa quantificada em tempo real foram padronizadas e validadas em nosso laboratório. Com base em nossos resultados, a técnica de imunofluorescência com o anticorpo anti-podocina foi a mais adequada para esse fim devido à sua maior especificidade. Nossos achados sugerem que tal técnica pode ser útil no acompanhamento de pacientes com glomeruloesclerose segmentar e focal e nefrite lúpica, na determinação de atividade das doenças, como um marcador laboratorial adicional independente dos níveis de proteinúria.

1. Podócitos. 2. Glomerulonefrite. 3. Proteinúria. 4. Técnica indireta de fluorescência para anticorpo. 5. Reação em cadeia da polimerase em tempo real.
Introduction: Podocytes are fundamental cells for maintaining the functionality of the glomerular filtration barrier, which is characterized by selective permeability. Podocyturia, excretion of podocytes in urine, has been studied in several glomerulopathies as a potential marker of disease activity. It is a non-invasive method that can reflect in real time the podocyte lesion, and it can be a more sensitive and earlier marker of this kind of lesion. It presents potential applicability in assessing the activity of glomerular diseases and understanding their pathogenesis, as well as guiding future therapeutic interventions. Objectives: To standardize and validate the methodology for the investigation of podocyturia by two techniques, indirect immunofluorescence and quantification by polymerase chain reaction in real time, in addition to determine which technique is most suitable for this purpose. Material and Methods: The study of podocyturia occurred in a group of 71 individuals, 21 (29,17%) patients with focal segmental glomerulosclerosis, 20 (27,78%) with lupus nephritis and 31 (43,06%) healthy individuals included as controls. Indirect immunofluorescence and reverse transcription polymerase chain reaction quantitative real time were used to determine the mRNA of specific podocyte proteins. Serum levels of creatinine and urinary protein/creatinine ratio were also evaluated, as well as the occurrence and intensity of disease activity based on clinical and laboratory parameters. Results: Podocyturia determined with anti-podocin antibody was statistically correlated with the urinary protein/creatinine ratio (p=0,013), and had a tendency to correlate with the relative gene expression of podocin mRNA in the urine (p = 0.056). The group of healthy individuals had significantly lower levels of podocyturia with anti-podocin than the group of diseased individuals, both when considered together and separately for disease (p=0,001 and p<0,001, respectively). The patient group presented higher relative gene expression than the group of healthy individuals (p=0,047). When each diagnosis was evaluated separately, only lupus nephritis presented greater relative gene expression than the group of healthy individuals (p=0,029). Conclusion: In the present study, the quantification techniques by indirect immunofluorescence and reverse transcription polymerase chain reaction quantitative real time were standardized and validated in our laboratory. Based on our results, the immunofluorescence technique with the anti-podocin antibody was the most suitable method because of its greater specificity. Our findings suggest that such technique may be useful in the monitoring of patients with segmental and focal glomerulosclerosis and lupus nephritis for determination of disease activity as an additional of the proteinuria leves.
1. Podocytes. 2. Glomerulonephritis. 3. Proteinuria. 4. Indirect fluorescence technique for antibody. 5. Real-time polymerase chain reaction.
0
PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

GLOMERULOPATIAS
GLOMERULOPATIA CLÍNICA
ESTUDO CLÍNICO E MARCADORES LABORATORIAIS EM GLOMERULOPATIAS

Banca Examinadora

GIANNA MASTROIANNI KIRSZTAJN
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
NELSON SASS Participante Externo
THAIS ALQUEZAR FACCA Participante Externo
JUSSARA LEIKO SATO TEBET Participante Externo
MICHELLE TIVERON PASSOS RIGUETTI Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
CONS NAC DE DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Bolsa de Mestrado GM e Doutorado GD 48

Vínculo

Servidor Público
Empresa Pública ou Estatal
Outros
Não