Os alimentos funcionais constituem uma importante área de pesquisa, uma vez que eles apresentam efeitos benéficos para a saúde e um ótimo valor nutricional. Dentre os alimentos funcionais, os considerados prebióticos, em especial os galacto-oligossacarídeos (GOS), apresentam efeito positivo na composição da microbiota intestinal, contribuindo para o aumento da população de Bifidobacterium e Lactobacillus. Eles são produzidos através da reação de transgalactosilação da lactose, pela enzima β-galactosidase, extraída de diversas fontes, sendo a microbiana a mais comum. Neste trabalho buscou-se isolar, selecionar e identificar leveduras produtoras de β-galactosidase, dos grãos de kefir de leite, para a produção de GOS, uma vez que eles consistem em um aglomerado de micro-organismos em simbiose, assimiladores de lactose ou não. Desta forma, os grãos de kefir provenientes de duas diferentes regiões (São Paulo e Santa Catarina) foram fermentados em diferentes meios com lactose, para posterior isolamento de micro-organismos, preferencialmente leveduras. Em seguida, os micro-organismos isolados foram submetidos ao crescimento em meio líquido com lactose para a produção da enzima β-galactosidase, e então as células foram permeabilizadas e a atividade enzimática foi mensurada. Os micro-organismos permeabilizados que se apresentaram viáveis, com as maiores atividades enzimáticas, foram colocados em meio com 20 % (m/v) de lactose para que a reação de transgalactosilação ocorresse, formando moléculas de GOS. Dos 26 isolados dos grãos de kefir, 20 apresentaram atividade enzimática, dos quais 7 foram utilizados para produção de GOS. O isolado J foi identificado pela técnica MALDI-TOF/MS com 99,99 % de confiança como Kluyveromyces marxianus, apresentando a maior concentração de GOS (39,34 mg.ml-1), e um rendimento de 19,67 % utilizando 0,51 U.mL-1 de enzima, 200 mg.mL-1 lactose, pH 6,5, 40°C. Durante este trabalho, foi demonstrado que os grãos de kefir se apresentam como uma boa fonte de micro-organismos eficientes na produção de β-galactosidase para transgalactosilação de lactose no prebiótico GOS.