O presente estudo teve como objetivo avaliar a estabilidade dos genes candidatos a referência Cancer Susceptibility Candidate 3 (CASC3), Eukaryotic Translation Elongation Factor 1 Alpha 2 (EEF1A2), Hydroxymethylbilane Synthase (HMBS), 18S Ribosomal RNA (18S), Actin Beta (ACTB), Glyceraldehyde-3-Phosphate Dehydrogenase (GAPDH) e Ubiquitin C (UBC), e selecionar os genes mais estáveis nos tecidos: fígado, músculo esquelético e jejuno de novilhos puros (Nelore) ou cruzados (Nelore x Angus) sob diferentes dietas para serem utilizados em análises de RT-qPCR. Além disso, para validar a seleção de genes de referência candidatos, a expressão dos genes alvos Maltase-Glucoamylase 2 (MGAM), Solute Carrier Family 2 Member 1 (SLC2A1), Stearoyl-CoA Desaturase (SCD), Acyl-CoA Oxidase 1 (ACOX1) e Fatty Acid Synthase (FAS) foram avaliadas usando os diferentes genes. Foram utilizados 14 novilhos puros e 14 cruzados, sendo que metade dos animais de cada grupo genético recebeu uma dieta contendo grãos de milho inteiro (GMI) e a outra metade grãos de milho inteiro e bagaço de cana de açúcar (GMIB). A análise de estabilidade foi realizada por meio do programa online RefFinder, que combina os algoritmos GeNorm, NormFinder, Bestkeeper e Delta-Cq. A ACTB esteve entre os três genes mais estáveis para cada tecido avaliado, já para os demais genes a estabilidade e a inclusão dos genes se alteraram a depender do tecido e raça. Os genes mais estáveis foram o 18S, ACTB e CASC3 para o músculo; para o fígado, HMBS, ACTB e 18S; e para o jejuno GAPDH, ACTB e CASC3, independente de raça e dieta. Ao se comparar os genes mais estáveis e menos estáveis como referência para normalização dos genes alvos FAS, ACOX1, MGAM e SCD, elucidou-se possíveis erros causados na análise dos dados. A utilização dos conjuntos de genes de referência mais estáveis e menos estáveis podem levar a diferentes conclusões a respeito do perfil de expressão do gene alvo estudado. Os resultados encontrados na validação dos genes de referência reforça o fato de que a seleção dos genes de referência mais adequados para cada experimento é de suma importância para garantir a confiabilidade dos estudos de expressão gênica para que possam ser aplicados na prática. Assim, o estudo demonstra a importância de se fazer análises prévias para cada condição experimental a ser estudada.