Microdomínios de membrana são frações de membrana enriquecidas em
glicoesfingolipídeos, esteróis e (glico)proteínas específicas; podendo
desempenhar papel fundamental em vários eventos biológicos como na
infectividade em fungos patogênicos. Durante o mestrado caracterizamos
microdomínios de membrana de leveduras de H. capsulatum, e demonstramos
que essas regiões são enriquecidas em ergosterol, glucosilceramida e na
proteína de 32kDa ligante à laminina, e que a remoção de ergosterol da
membrana plasmática com metilβ-ciclodextrina (mβCD), desestabiliza os
microdomínios, reduzindo a capacidade de H. capsulatum de infectar
macrófagos alveolares. A p32 foi isolada de frações de membranas resistentes
a detergente não iônico (Brij 1% à 4C) obtidas por ultracentrifugaçnao em
gradiente de sacarore e por imunoprecipitação com laminina e anticorpos antilaminina
conjugado à Sepharose-proteína-A. O imunoprecipitado foi submetido
à SDS-PAGE e a banda correspondente a p32 isolada do gel, submetida ao
tratamento tríptico e os 5 fragmentos obtidos, e analisados por espectrometria
de massas, onde detectamos pelo MASCOT uma proteína com “score”
significativo de 194, contendo a sequência “RGD” entre os aminoácidos 222-
231, sugerindo a interação com a laminina. Proteínas similares foram
detectadas, mantendo a sequência RGD conservada, em outros fungos, no
entanto sem caracterização ou função. Com o objetivo de investigar se outros
componentes de microdomínios de membrana de fungos, como a
glucosilceramida poderia também modular a infectividade, realizamos
experimentos utilizando leveduras controles e protoplastos C. albicans obtidos
após tratamento com Zymolase (2mg/ml – 2 horas) e imunomarcação com
XIV
anticorpos anti-glucosilceramida (MEST-2). Em microscopia confocal
observamos que a imunomarcação de glucosilceramida nos protoplastos está
espalhada em vesículas da C. albicans, porém em leveduras controle a
distribuição da glucosilceramida esta distribuída entre a membrana plasmática
e a parede celular. Na infectividade de leveduras controle e protoplastos de C.
albicans em macrófagos peritoneais murinos, foi observada uma polarização na
distribuição da glucosilceramida dos protoplastos na região da infecção,
mostrando que os essas moléculas podem ser importantes em eventos de
infectividade; já em leveduras controle não conseguimos ver o mesmo. Esses
dados podem ajudar em futuros estudos da interação entre fungo-célula
hospedeira e eventualmente para o desenvolvimento de medicamentos contra
as infecções causadas por eles.
1.Microdomínios de membrana, 2.Fungos patogênicos, 3.Protoplastos, 4.Interações Hospedeiro-Parasita, 5.Infectividade
Membrane microdomains are membrane fractions enriched in
glycosphingolipids, sterols and (glycol) specific proteins; being able
play a key role in many biological events such as
infectivity in pathogenic fungi. During the master's degree, we
yeast membrane microdomains of H. capsulatum, and we demonstrated
that these regions are enriched in ergosterol, glucosylceramide and
laminin-binding 32kDa protein, and that the removal of ergosterol from
plasma membrane with methyl β-cyclodextrin (mβCD), destabilizes
microdomains, reducing the ability of H. capsulatum to infect
alveolar macrophages. P32 was isolated from fractions of resistant membranes
nonionic detergent (Brij 1% at 4C) obtained by ultracentrifugation in
sucrose gradient and by immunoprecipitation with laminin and anti-aminin antibodies
conjugated to Sepharose-protein-A. The immunoprecipitate was
SDS-PAGE and the band corresponding to p32 isolated from the gel, submitted to
tryptic treatment and the 5 fragments obtained, and analyzed by spectrometry
of masses, where we detected by MASCOT a protein with "score"
significant of 194, containing the sequence "RGD" between amino acids 222-
231, suggesting interaction with laminin. Similar proteins were
detected, keeping the RGD sequence conserved in other fungi in the
without characterization or function. In order to investigate whether other
components of fungal membrane microdomains, such as
glucosylceramide could also modulate infectivity, we performed
experiments using yeast controls and protoplasts C. albicans obtained
after treatment with Zymolase (2mg / ml - 2 hours) and immunolabeling with
XIV
anti-glycosylceramide antibodies (MEST-2). In confocal microscopy
we observed that the immunostaining of glucosylceramide in the protoplasts is
in vesicles of C. albicans, but in control yeasts
Glucosylceramide distribution is distributed between the plasma membrane
and the cell wall. In the infectivity of control yeasts and protoplasts of C.
albicans in murine peritoneal macrophages, a polarization was observed in the
distribution of protoplast glucosylceramide in the region of infection,
showing that these molecules may be important in
infectivity; already in yeast control we can not see the same. Those
data may help in future studies of the interaction between fungus-cell
and, where appropriate, for the development of contraceptive
the infections caused by them.
1. Membrane micro-domains, 2. Pathogenic pathogens, 3. Protoplasts, 4. Host-parasite interactions, 5.Infectivity