Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA MOLECULAR) (33009015001P0)
COMPOSIÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE MOLÉCULAS RELEVANTES DE MICRODOMÍNIOS DE FUNGOS PATOGÊNICOS PARA INFECTIVIDADE.
TANIL GOIS LACERDA FILHO
TESE
27/09/2018

Microdomínios de membrana são frações de membrana enriquecidas em glicoesfingolipídeos, esteróis e (glico)proteínas específicas; podendo desempenhar papel fundamental em vários eventos biológicos como na infectividade em fungos patogênicos. Durante o mestrado caracterizamos microdomínios de membrana de leveduras de H. capsulatum, e demonstramos que essas regiões são enriquecidas em ergosterol, glucosilceramida e na proteína de 32kDa ligante à laminina, e que a remoção de ergosterol da membrana plasmática com metilβ-ciclodextrina (mβCD), desestabiliza os microdomínios, reduzindo a capacidade de H. capsulatum de infectar macrófagos alveolares. A p32 foi isolada de frações de membranas resistentes a detergente não iônico (Brij 1% à 4C) obtidas por ultracentrifugaçnao em gradiente de sacarore e por imunoprecipitação com laminina e anticorpos antilaminina conjugado à Sepharose-proteína-A. O imunoprecipitado foi submetido à SDS-PAGE e a banda correspondente a p32 isolada do gel, submetida ao tratamento tríptico e os 5 fragmentos obtidos, e analisados por espectrometria de massas, onde detectamos pelo MASCOT uma proteína com “score” significativo de 194, contendo a sequência “RGD” entre os aminoácidos 222- 231, sugerindo a interação com a laminina. Proteínas similares foram detectadas, mantendo a sequência RGD conservada, em outros fungos, no entanto sem caracterização ou função. Com o objetivo de investigar se outros componentes de microdomínios de membrana de fungos, como a glucosilceramida poderia também modular a infectividade, realizamos experimentos utilizando leveduras controles e protoplastos C. albicans obtidos após tratamento com Zymolase (2mg/ml – 2 horas) e imunomarcação com XIV anticorpos anti-glucosilceramida (MEST-2). Em microscopia confocal observamos que a imunomarcação de glucosilceramida nos protoplastos está espalhada em vesículas da C. albicans, porém em leveduras controle a distribuição da glucosilceramida esta distribuída entre a membrana plasmática e a parede celular. Na infectividade de leveduras controle e protoplastos de C. albicans em macrófagos peritoneais murinos, foi observada uma polarização na distribuição da glucosilceramida dos protoplastos na região da infecção, mostrando que os essas moléculas podem ser importantes em eventos de infectividade; já em leveduras controle não conseguimos ver o mesmo. Esses dados podem ajudar em futuros estudos da interação entre fungo-célula hospedeira e eventualmente para o desenvolvimento de medicamentos contra as infecções causadas por eles.

1.Microdomínios de membrana, 2.Fungos patogênicos, 3.Protoplastos, 4.Interações Hospedeiro-Parasita, 5.Infectividade
Membrane microdomains are membrane fractions enriched in glycosphingolipids, sterols and (glycol) specific proteins; being able play a key role in many biological events such as infectivity in pathogenic fungi. During the master's degree, we yeast membrane microdomains of H. capsulatum, and we demonstrated that these regions are enriched in ergosterol, glucosylceramide and laminin-binding 32kDa protein, and that the removal of ergosterol from plasma membrane with methyl β-cyclodextrin (mβCD), destabilizes microdomains, reducing the ability of H. capsulatum to infect alveolar macrophages. P32 was isolated from fractions of resistant membranes nonionic detergent (Brij 1% at 4C) obtained by ultracentrifugation in sucrose gradient and by immunoprecipitation with laminin and anti-aminin antibodies conjugated to Sepharose-protein-A. The immunoprecipitate was SDS-PAGE and the band corresponding to p32 isolated from the gel, submitted to tryptic treatment and the 5 fragments obtained, and analyzed by spectrometry of masses, where we detected by MASCOT a protein with "score" significant of 194, containing the sequence "RGD" between amino acids 222- 231, suggesting interaction with laminin. Similar proteins were detected, keeping the RGD sequence conserved in other fungi in the without characterization or function. In order to investigate whether other components of fungal membrane microdomains, such as glucosylceramide could also modulate infectivity, we performed experiments using yeast controls and protoplasts C. albicans obtained after treatment with Zymolase (2mg / ml - 2 hours) and immunolabeling with XIV anti-glycosylceramide antibodies (MEST-2). In confocal microscopy we observed that the immunostaining of glucosylceramide in the protoplasts is in vesicles of C. albicans, but in control yeasts Glucosylceramide distribution is distributed between the plasma membrane and the cell wall. In the infectivity of control yeasts and protoplasts of C. albicans in murine peritoneal macrophages, a polarization was observed in the distribution of protoplast glucosylceramide in the region of infection, showing that these molecules may be important in infectivity; already in yeast control we can not see the same. Those data may help in future studies of the interaction between fungus-cell and, where appropriate, for the development of contraceptive the infections caused by them.
1. Membrane micro-domains, 2. Pathogenic pathogens, 3. Protoplasts, 4. Host-parasite interactions, 5.Infectivity
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

BIOQUIMICA
IMUNOQUIMICA DE GLICOCONJUGADOS
IMUNOQUÍMICA E FUNÇÃO DE ANTIGENOS DE PARASITAS E FUNGOS

Banca Examinadora

HELIO KIYOSHI TAKAHASHI
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
ANALY SALLES DE AZEVEDO MELO Participante Externo
ALEXANDRE KEIJI TASHIMA Docente - PERMANENTE
CARLOS PELLESCHI TABORDA Participante Externo
GIL BENARD Participante Externo

Vínculo

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Sim