O queijo artesanal serrano é um produto típico da região sul do Brasil e se caracteriza por ser produzido a partir de leite cru, em propriedades rurais. A contaminação desse alimento por Escherichia coli e Listeria monocytogenes assume grande relevância para a saúde pública, pois oferece risco a saúde dos consumidores. O objetivo desse estudo foi investigar a presença de genes de virulência e traçar o perfil de susceptibilidade de E. coli e L. monocytogenes aos antimicrobianos, bem como verificar a potencial capacidade de formação de biofilme de E. coli isolados de leite cru e queijo artesanal serrano produzidos no estado de Santa Catarina, região sul do Brasil. Um total de 117 isolados de E. coli e 9 de L. monocytogenes (sorotipos 1/2b e 4b) foram caracterizadas por meio de reações de PCR para detecção dos seguintes genes de virulência: eae para E. coli enteropatogênica (EPEC), lt e st para E. coli enterotoxigênica (ETEC), stx para E. coli enterohemorrágica (EHEC), ipaH para E. coli enteroinvasica (EIEC), aggR para E. coli enteroagregativa (EAEC) e hly, inlA, inlC, inlJ, actA, plcB e iap para L. monocytogenes. O perfil de susceptibilidade de E. coli e L. monocytogenes à 23 e 12 antimicrobianos, respectivamente, foi determinado fenotipicamente por meio da técnica de disco difusão e a busca de isolados de E. coli produtores de Beta-lactamases de espectro estendido (ESBL) e carbapenemase foram realizadas genotipicamente pela detecção dos genes BlaTEM, BlaSHV, BlaOXA, BlaCTX-M para ESBL e BlaOXA-48 para carbapenemase. Adicionalmente, a potencial capacidade dos isolados de E. coli em produzir biofilme foi determinada pela técnica do ágar vermelho Congo. Os genes de virulência de E. coli foram identificados em 21,36% dos isolados testados, que foram classificados em EPEC (patótipo mais prevalente), ETEC ou EAEC. Dez (8,55%) dos isolados de E. coli, apresentaram perfil de multirresistência, enquanto que quatro (3,41%) foram classificados como produtores de ESBL, sendo identificado o gene BlaTEM. Nenhum isolado foi classificado como produtor de carbapenemase e 67,52% foram considerados potenciais produtores de biofilme. Todos os isolados de L. monocytogenes apresentaram os genes hly e plcB, enquanto que os demais genes (iap, actA, inlA, inlC e inlJ) foram detectados em oito isolados (88,9%). Verificou-se que todos os isolados foram resistentes à pelo menos um antimicrobiano e 33,3% apresentaram perfil de multirresistência. Esses resultados alertam para um problema de saúde pública, pois o queijo artesanal serrano oferece risco a saúde dos consumidores e evidenciam a necessidade de melhoria e adequações nos processos de fabricação desses produtos, a fim de evitar a disseminação de micro-organismos potencialmente patogênicos.