Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS (22003010001P1)
NESTED PCR-DUPLEX E ANÁLISE FILOGENÉTICA DE ISOLADOS DE LENTIVÍRUS DE PEQUENOS RUMINANTES
REBECA CAVALCANTE MARINHO
TESE
18/05/2018

As ferramentas moleculares são de grande importância para a realização do diagnóstico precoce das lentiviroses de pequenos ruminantes, bem como para permitir uma caracterização das cepas circulantes nos rebanhos. A caracterização molecular dos lentivírus de pequenos ruminantes (LVPR) pode auxiliar no estudo das potenciais diferenças na virulência entre as linhagens circulantes, compreender suas relações genéticas, patogênese, epidemiologia e sua inclusão nos grupos estabelecidos, bem como pode ser relevante para o desenvolvimento de testes de diagnósticos mais sensíveis. Dessa forma, o objetivo deste projeto foi padronizar uma técnica de Nested PCR-duplex que permitisse a detecção simultânea de LVPR e ainda realizar a caracterização molecular desses vírus a partir do sequenciamento parcial das regiões gag e LTR de lentivírus de pequenos ruminantes isolados de caprinos e ovinos. Para tanto foram coletadas amostras de sangue de ovinos e caprinos, para realização de um levantamento sorológico, através de IDGA e Nested PCR convencional. Para realização da PCR-Duplex, foram confeccionados os pares de primers para cada região (gag, pol e LTR), sendo estes ancorados em regiões mais conservadas dentro destes genes. A PCR-duplex foi realizada e padronizada utilizando amostras padrões positivas (CAEV Cork e MVV K1514), visando avaliar a capacidade de detecção da técnica desenvolvida. Finalmente, foram realizadas Nested-PCR e PCR-Duplex de amostras de campo a fim de determinar a capacidade de detecção da técnica desenvolvida. As amostras virais isoladas foram sequenciadas e as regiões gag e LTR analisadas. Os resultados obtidos demonstraram que os primers para a região LTR são mais específicos para detecção de Lentivírus ovino, enquanto os primers para as regiões gag e pol são mais específicos para detecção dos Lentívirus de caprinos. Além disso, a PCR-Duplex desenvolvida permitiu a detecção simultânea dos Lentivírus ovinos e caprinos em um único ensaio, sendo uma ferramenta de diagnóstico valiosa para detecção de LVPR. O sequenciamento genético das amostras de campo demonstrou que não houve nenhum caso de infecção cruzada, uma vez que as amostras de ovinos pertecem ao grupo filogenético do MVV K1514 e as cepas de caprinos estão melhor relacionadas com o grupo do CAEV Cork. A última etapa da experimentação envolveu um estudo clínico, patológico e molecular de isolados do vírus Maedi Visna (MVV) detectado em ovinos da região nordeste do estado do Pará. Para realização desse estudo, foram realizados exames clínicos, testes sorológicos através da técnica de IDGA, isolamento viral a partir de co-cultivo de leucócitos em células de membrana sinovial ovina (MSO) e Nested-PCR para confirmação do diagnóstico pelo método molecular. As amostras virais isoladas foram sequenciadas e comparadas com sequencias conhecidas previamente depositadas no banco de dados. Um animal veio a óbito durante a experimentação, o que possibilitou a realização de necropsia e exames histopatológicos para pesquisa de lesões relacionadas com a infecção por MVV. Após a realização dos testes verificou-se a ocorrência do MVV na região estudada, causando quadro de lesões nos animais acometidos. Após o sequenciamento genético verificou-se que as cepas isoladas são relacionadas com o grupo do MVV K1514 e ainda que a região gag é uma região bem mais conservada do que a região LTR.

PCR-Duplex, diagnóstico, molecular, LVPR, sequenciamento.
The molecular tools are of great importance for the early diagnosis of lentiviruses of small ruminants, as well as to allow a characterization of the circulating strains in the herds. The molecular characterization of lentiviruses of small ruminants (SRLV) may help to study the potential differences in virulence among circulating strains, to understand their genetic relationships, pathogenesis, epidemiology and their inclusion in established groups, as well as to be relevant for the development of tests of more sensitive diagnoses. Thus, the objective of this project was to standardize a Nested PCR-duplex technique that would allow the simultaneous detection of SRLV and to carry out the molecular characterization of these viruses from the partial sequencing of the gag and LTR regions of lentiviruses of small ruminants isolated from goats and sheep. For this purpose, blood samples from sheep and goats were collected for a serological survey using conventional AGID and Nested-PCR. For the duplex-PCR, the pairs of primers were prepared for each region (gag, pol and LTR), being anchored in regions more conserved within these genes. PCR-duplex was performed and standardized using standard positive samples (CAEV Cork and MVV K1514), aiming to evaluate the detection ability of the developed technique. Finally, Nested-PCR and PCR-Duplex field samples were performed in order to determine the detection ability of the developed technique. The isolated viral samples were sequenced and the gag and LTR regions analyzed. The results showed that the primers for the LTR region are more specific for detection of sheep lentivirus, while the primers for the gag and pol regions are more specific for the detection of goat lentiviruses. In addition, the developed Duplex-PCR allowed the simultaneous detection of ovine and caprine lentiviruses in a single assay. Being a valuable diagnostic tool for SRLV detection. Genetic sequencing of the field samples showed that there was no case of cross-infection, since the sheep samples belong to the MVV K1514 phylogenetic group and the goat strains are better related to the CAEV Cork group. The last stage of the experiment involved a clinical, pathological and molecular study of Maedi Visna virus (MVV) isolates detected in sheep from the northeastern region of the state of Pará. To perform this study, clinical tests and serological tests were performed using the AGID technique, viral isolation from leukocyte co-culture in sheep synovial membrane (MSO) and Nested-PCR to confirm the diagnosis by the molecular method. The isolated viral samples were sequenced and compared to known sequences previously deposited in the database. One animal died during the experiment, which allowed necropsy and histopathological examination to investigate lesions related to MVV infection. After the tests were performed the MVV occurred in the region studied, causing lesions in the affected animals. After genetic sequencing it was found that the isolated strains are related to the MVV K1514 group and that the gag region is a much more conserved region than the LTR region.
Duplex PCR, diagnostic, molecular, SRLV, sequencing.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
O trabalho possui divulgação autorizada

Contexto

REPRODUÇÃO E SANIDADE ANIMAL
REPRODUÇÃO E SANIDADE DE PEQUENOS RUMINANTES
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Banca Examinadora

MARIA FATIMA DA SILVA TEIXEIRA
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
LORENA MAYANA BESERRA DE OLIVEIRA Participante Externo
KELMA COSTA DE SOUZA Participante Externo
EDMARA CHAVES COSTA Participante Externo
FRANCISCO ESMAILE DE SALES LIMA Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUNDACAO CEARENSE DE APOIO AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Estímulo à Cooperação Científica e Desenvolvimento da Pós-Graduação 48

Vínculo

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Ensino e Pesquisa
Sim