Dados do Trabalhos de Conclusão

FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
Bioexperimentação (42009014009P7)
DESENVOLVIMENTO DE UM ELISA in house INDIRETO BASEADO NA PROTEÍNA p24 RECOMBINANTE PARA DIAGNÓSTICO DA LEUCOSE ENZOÓTICA EM BOVINOS
ANA PAULA ANDREOLLA
DISSERTAÇÃO
07/08/2017

O vírus da leucemia bovina (BLV) é o agente etiológico da leucose enzoótica bovina (LEB), uma doença infecciosa persistente e altamente prevalente no gado leiteiro. Testes sorológicos e remoção de animais infectados são fundamentais para o controle da doença. No Brasil, a imunodifusão em gel de ágar (IDGA) usando o BLV produzido em cultivo de células de rim fetal de carneiro é o único teste comercial genuinamente brasileiro disponível para o diagnóstico da LEB. Para suprir essa deficiência no diagnóstico, desenvolvemos um ELISA indireto com base na proteína recombinante do capsídeo viral (p24) do BLV para detectar anticorpos em bovinos com diferentes aptidões. Para isso, foi desenhado um par de primer para amplificar por meio da PCR a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína p24, clonando o DNA resultante no plasmídeo pET-20. O plasmídeo foi clonado em Escherichia coli ER2566 cálcio-competente e a expressão da proteína foi induzida com IPTG (0.1mM). A proteína resultante (BLVp24r) foi purificada pelo sistema de cromatografia através da coluna HisTrap acoplada no equipamento ÄKTA Pure Chromatography e, posteriormente, analisada por SDS-PAGE. As características de antigenicidade e imunogenicidade da BLVp24r foram avaliadas através da técnica de Western Blot, utilizando soro policlonal de ratos imunizados com a BLVp24r e soro de bovinos naturalmente infectados, para posterior desenvolvimento do ELISA. Para o ELISA, o tipo de microplaca, a concentração de antígeno e a diluição de soro ideal foram determinados por titulação seriada das amostras. A análise da curva de Característica de Operação do Receptor (ROC) e a Análise de Área sob Curva (AUC) foram utilizadas para avaliar o desempenho do ELISA desenvolvido. Ao fim da padronização, realizamos um estudo soroepidemiológico da prevalência de anticorpos anti-BLV em soros de bovinos. A proteína BLVp24r foi expressa com a proteína de fusão com peso molecular de 67 KDa.. O soro de ratos imunizados e soro de bovinos naturalmente infectados com BLV reconheceram somente a proteína BLVp24r por Western Blot. A microplaca Polysorp® obteve melhor performance no ELISA com BLVp24r utilizando 50 ng/poço de proteína e soro bovino diluído a 1:100. O ELISA indireto padronizado para BLV possui um cut-off de 0.320 na OD450nm e apresentando uma sensibilidade de 98.5% e especificidade de 100%. A ROC representa um valor da ASC de 0,9989 (intervalo de confiança de 95% de 0,9961 em 1,002; p <0,0001), o que indica um alto nível de precisão. Com o ELISA padronizado, realizamos um estudo soroepidemiológico para validação do teste utilizando soros bovinos, demonstrando que a prevalência de anticorpos para o BLV foi de 31.1% em bovinos de leite e de 9.5% em bovinos de corte. O ELISA desenvolvido e otimizado utilizando a BLVp24r como antígeno é adequado para detectar anticorpos anti-BLV em soros bovinos e pode ser considerado um forte candidato a kit comercial visando o controle de BLV em bovinos.

Leucose enzoótica bovina, padronização, ELISA indireto, soroprevalência.
Bovine Leukemia Virus (BLV) is the etiological agent of enzootic bovine leukemia (EBL) a persistent infectious disease highly prevalent in dairy cattle. Serological testing and culling infected animals are central to disease control. The agar gel immunodiffusion (AGID) assay that uses BLV cultivated in Fetal Lamb Kidney cells is the only assay produced in Brazil and used in most laboratories for EBL diagnosis. Aiming to fulfil this gap, we developed an indirect ELISA based on the recombinant capsid protein (p24) of BLV to detect antibodies in cattle. To reach our goals, we designed PCR primers to amplify the nucleotides coding for the p24 protein and cloned the resulting DNA fragment in the pET-20 plasmid. The resulting plasmid was transformed in competent E. coli ER2566 and the protein expression was induced by IPTG (0.1mM). The protein (BLVp24r) was purified using a HisTrap column coupled to an ÄKTA Pure Chromatography equipment, and later analyzed by SDS-PAGE. The antigenicity and immunogenicity of the BLVp24r were evaluated by Western blot using sera from rats immunized with BLVrp24 and with sera from naturally infected cows prior to the development of the ELISA. For the ELISA, the microplate type, antigen concentration and serum dilution were determined by checkboard analysis. The receptor operation characteristics (ROC) curve analysis and the area under the curve (AUC) analysis were used to evaluate the ELISA performance. After that, the ELISA was used to evaluate the prevalence of anti-BLV antibodies in cattle blood. The BLVp24r protein was expressed as a fusion protein and had a molecular mass of 67 KDa. Only the serum from immunized rats and from cattle naturally infected with BLV recognized the BLVp24r by Western blot. The PolySorp® plates provide the best performance on the BLVp24r ELISA with 50 ng/well of the protein and with bovine serum diluted 1:100. Our indirect ELISA to BLV was set with a cut-off value of 0.320 at OD450nm and had sensibility of 98.5% and 100% specificity. The ROC had an AUC value of 0.9989 (95% confidence interval from 0.9961 to 1.002), indicating high level of precision. With this ELISA we screened sera samples from cattle and found a prevalence of antibodies to BLV in 31.1% of dairy cattle and 9.5% in beef cattle. The BLVp24r is suitable to detect antibodies to BLV in bovine serum by ELISA and should be a strong candidate for the development of a commercial assay aiming to control EBL in cattle.
enzootic bovine leukemia, standardization, indirect ELISA, seroprevalence.
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PORTUGUES
FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE PASSO FUNDO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

BIOEXPERIMENTAÇÃO
ETIOPATOGENIA, EPIDEMIOLOGIA, E DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DE DOENÇAS TRANSMISSÍVEIS E NÃO TRANSMISSÍVEIS
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Banca Examinadora

LUIZ CARLOS KREUTZ
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
DAISY MARIA STROTTMANN Participante Externo
DENIZ ANZILIERO Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Suporte à Pós-Graduação de Instituições de Ensino Particulares (módulo Taxas) 24

Vínculo

Bolsa de Fixação
Instituição de Ensino e Pesquisa
Ensino e Pesquisa
Não