A utilização de células-tronco mesenquimais (CTM) em biotecnologias da reprodução tem emergido nos últimos anos. Durante o cultivo in vitro, as CTM secretam fatores de crescimento, substâncias anti-apoptóticas e/ou antioxidantes. Este meio em que as CTM são cultivadas é chamado de meio condicionado (MC) e poderia ser um meio alternativo para o cultivo de folículos ovarianos. Entretanto, ainda não há informações sobre o efeito do MC de CTM no cultivo in vitro de folículos secundários ovinos. Desta forma, o objetivo deste estudo foi verificar a influência do MC de CTM da geleia de Wharton sobre o desenvolvimento in vitro de folículos secundários ovinos isolados. As CTM oriundas da Geleia de Wharton ovina (CTM-GWo) foram isoladas e cultivadas até a 3ª passagem para a obtenção do MC. As CTM-GWo foram submetidas aos ensaios de Unidade Formadora de Colônia Fibroblastóide (UFC-F) e de diferenciação adipogênica, condrogênica e osteogênica. Em seguida, folículos secundários (300-350 μm) foram isolados e cultivados durante 6 dias, em: 1) α-Meio Essencial Mínimo (α-MEM) suplementado com glutamina, hipoxantina, insulina, transferrina, selênio, ácido ascórbico e albumina sérica bovina (denominado de α-MEM+); 2) 50% de α-MEM+ + 50% de MC de CTM (denominado α-MEM+MC) ou 3) MC de CTM (denominado MC). No início (dia 0) e final do cultivo (dia 6), os folículos foram avaliados quanto à morfologia (folículos normais) e ao crescimento (formação de antro e diâmetro folicular). Ao final do cultivo, determinou-se a percentagem de oócitos totalmente crescidos (oócitos >110 μm), os níveis de espécies reativas de oxigênio (ERO) e glutationa (GSH), a atividade mitocondrial e a retomada da meiose dos oócitos. As percentagens de sobrevivência folicular, formação de antro, oócitos completamente crescidos e retomada da meiose foram comparadas pelo teste do Qui-quadrado. Os dados de diâmetro folicular e taxa de crescimento geral foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov, análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey. Os dados de níveis de ERO, GSH e de atividade mitocondrial foram submetidos ao Shapiro-Wilk. Os níveis de ERO foram comparados pelo Kruskal-Wallis. Os dados de níveis de GSH e de atividade mitocondrial foram comparados pela ANOVA e teste de Tukey. Os resultados de UFC-F e diferenciações adipogênica, condrogênica e osteogênica confirmaram o potencial multipotente das CTM-GWo, para a obtenção do MC. Após o cultivo, não foi observada diferença significativa na percentagem de folículos normais, de formação de antro e de oócitos completamente crescidos, nos níveis de GSH e na retomada da meiose entre os tratamentos. No dia 6 de cultivo, houve um aumento (P<0,05) no diâmetro folicular no tratamento α-MEM+MC em relação aos demais tratamentos. Além disso, o tratamento MC sozinho apresentou maior (P<0,05) diâmetro folicular quando comparado ao α-MEM. Os tratamentos α-MEM+MC e MC sozinho apresentaram maior (P<0,05) taxa de crescimento geral e menores (P<0,05) níveis de ERO em relação ao α-MEM. A atividade mitocondrial foi maior (P<0,05) em oócitos de folículos cultivados em α-MEM e α-MEM+MC do que em MC sozinho. Em conclusão, o MC de CTM-GWo pode ser utilizado como um meio alternativo para manter a sobrevivência, promover o crescimento e reduzir níveis de ERO de folículos secundários ovinos isolados.