Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA MOLECULAR) (33009015001P0)
Terapia Gênica de Isquemia de Membro de Camundongo com os Genes Gm-Csf e M-Csf
BARBARA SAMPAIO DIAS MARTINS MANSANO
DISSERTAÇÃO
18/01/2018

Objetivos: Estudar a interação entre os fatores GM-CSF e M-CSF na recuperação de membros isquêmicos. Métodos: A isquemia de membro foi induzida através da remoção da artéria femoral de camundongos Balb/c machos de 10-12 semanas de idade. Três dias depois, o músculo retofemoral foi eletroporado com 100 ug de plasmídeo uP-mGMCSF e, após dois dias, também foi transfectado 100 ug de plasrnídeo uP-mMCSF. Ao longo de duas semanas, a expressão gênica foi obtida por ELlSA e o perfil leucocitário por hemograma. Semanalmente, imagens do fluxo sanguíneo foram obtidas através de !aser Dopp!er e escores visuais de necrose foram determinados. Trinta dias após a transfecção, a massa e a força dos músculos gastrocnêmio foram avaliadas, sendo que os músculos gastrocnêmíos foram coletados para análise histológica. Neste trabalho, os seguintes grupos foram incluídos: Camundongos não isquêmicos (NI), não isquêmicos eletroporados com uPmGMCSF (NluPGm) e não isquêmicos eletroporados com uP-mMCSF (NluPM), não isquêmicos eletroporados com uP-mGMCSF e uP-mMCSF (luPGmM), isquêmicos não tratados (I), isquêmicos transfectados com o vetor uP-vazio (luP), isquêmicos tratados com uP-mGMCSF (luPGm) e isquêmicos tratados com uP-mMCSF (luPM) e isquêmícos tratados com uP-mGMCSF e uP-mMCSF (luPGmM). Resultados: Os picos das expressões de GM-CSF e de M-CSF ocorreram entre os dias 2 e 4. Na primeira semana, o grupo luPGm mostrou contagens aumentadas de todas as células sanguíneas analisadas, enquanto que o grupo luPM mostrou aumento somente na contagem de monócitos. Ao final de 30 dias, o grupo luPGmM obteve maior fluxo sanguíneo na pata isquêmica (em %) (46,6±12,3) em relação aos grupos I(34,7±19,0), luP (29,3±8,9), luPGm (26,8±7,9) e luPM (34,8±15,5). Os escores de necrose das patas isquêmicas mostraram que a maioria dos camundongos não obteve necrose, sendo que, nos grupos luPGm e luPM um máximo de necrose na região do pé foi observado e, nos outros grupos, o grau 2 foi o rnaior encontrado. As funcionalidades dos músculos gastrocnêmio (em N/g) dos grupos luPGm (1,5±0,6), luPM (2,3±O,9) e luPGmM (1,1±O,8) foram melhores quando comparado com os grupos I (O,3±O,1)e luP (0,4±O,2), mas ainda não atingindo a funcionalidade muscular do grupo Nl (3,5±O,8). Análises histológicas dos músculos gastrocnêmio após os 30 dias experimentais mostraram que os animais do grupo luPGmM apresentaram aumento da contagem de arteríolas e capilares, de infiltrados de adipócitos, de deposição de colágeno e dos subtipos M1 e M2 de macrófagos, sendo que as fibras musculares se mostraram mais calibrosas e: com menor incidência de fibras em regeneração. Conclusão: A terapia gênica com GM-CSF e M-CSF promoveu a retomada do fluxo sanguíneo na pata isquêmica dos camundongos e melhorou a funcionalidade muscular.

i. Doença Arrerial Periferica. 2. lsquernia de membros, 3. Terapia gênica. 4. GM-CSF. 5. M-CSF. 6. Macrófagos.
Objectives: To study the interaction between the GM-CSF e M-CSF factors on the recovery of ischemic members. Methods: The limb ischemia was induced through the removal of the femoral artery of Balb/c male mice of 10 to 12 weeks old. Three days later, the rectus femoris muscle was electroporaíed with 100 ug of uP-mGMCSF plasmidium and, two days later, was also transfected with 100 ug of uP-mMCSF. Throughout two weeks, the genic expression was obtained by ELlSA and the leukocyte profile by blood count. Week/y, blood flow images were obtained through laser Doppler and visual scores of necrosis were determined. Thírty days after the transfection, the mass and strength of the gastrocnemius muscles were evaluated, also having the gastrocnemius muscles collected for histalagical analysis. In the current work, the foliowing groups were included: Non-Ischemic Mice (NI), Non Ischemic Electroporated with uP-mGMCSF (NluPGm) and Non Ischemic Electroporated with uP-mMCSF (NluPM), Non /schemic Electroporated with uP-mGMCSF and uP-mMCSF (luPGmM), Ischemic Non Treated (I), Ischemic Transfected with the empty-uP Vector (luP), Ischemic Treated with uP-mGMCSF (/uPGm) and Ischemic Treated with uP-mMCSF (luPM) and Ischemic Treated with uP-mGMCSF and uP-mMCSF (luPGmM). Results: The expression peaks of GM-CSF and M-CSF occurred between the days 2 and 4. On the first week, the luPGm group showed increased counts of ali the blood cells analyze, while the luPM group shown an increase exclusively on the count of monocytes. By the end of 30 days, the iuPGmM group obtained the highest b/ood flow on the ischemic limb (in %) (46,6±12,3) in comparison to the I (34,7±19,0), luP (29~3±S,9), luPGm (26,S±7,9) e luPM (34,S±15,5) groups. The ischemic límb necrosis score shown that most of the mice didn't have necrosis, in which, on the luPGm and luPM groups a maximum of necrosis on the feet region was seen and, on the other groups, grade 2 was the highest found. lhe functiona\ity of the gastrocnemius muscles (in Nlg) of the luPGm (1,5±0,6), luPM (2,3±0,9) e luPGmM (1,1±0,S) groups were best when compared to the I (0,3±0,1) e luP (0,4±0,2) groups, but still not reaching the muscle functionality of the Ni (3,5±0,S) group. Histological analyzes of the gastrocnemius muscles followed by the 30 experimental days shown that the animais of the luPGmM group presented an increase on the count of: arterioles and capillaries, adipocytes infiltration, collagen deposition and on the M1 and M2 subtypes of macrophages, being that the muscular fibers have shown to have greater calibers and lower incidence of fibers in regeneration. Conclusion: The gene therapy wíth GM-CSF and M-CSF promoted the recovery of blood flow on the ischemic Iimb of mice and improved muscular functionality.
Peripheral Artery Disease. 2. Lsquernia of members, 3. Gene therapy. 4. GM-CSF. 5. M-CSF. 6. Macrophages.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

BIOFISICA
ESTRUTURA, ATIVIDADES E SINTESE DE PEPTIDEOS E PROTEINAS
TERAPIA GÊNICA

Banca Examinadora

SANG WON HAN
DOCENTE - PERMANENTE
Não
Nome Categoria
EDGAR JULIAN PAREDES GAMERO Docente - COLABORADOR
LUCIOLA DA SILVA BARCELOS Participante Externo
VANESSA MOREIRA Participante Externo

Vínculo

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Não