Nome completo do autor da tese de dissertação: Ana Luiza Silva Guimarães
Título da dissertação: Identificação de marcadores não invasivos para a competência
ovocitária em bovinos
Nome do curso: Doutorado em Ciências Animais
Data de defesa: 29/09/2017
Orientador: Margot Alves Nunes Dode
Palavras-chaves: antioxidantes, biópsia, competência ovocitária, cultivo individual,
metilação de DNA, RNAm
Keywords: antioxidants, biopsy, oocyte competence, individual culture, DNA
methylation, mRNA.
Resumo em Português
O presente estudo objetivou determinar o melhor sistema de cultivo individual a ser
utilizado e a quantidade relativa de RNAm de genes candidatos à marcadores de
competência em biópsias de células do cumulus (CC) imaturas e maturadas de ovócitos
com alta e baixa capacidade de produzir embriões in vitro. Foram realizados dois
experimentos, sendo que no primeiro foram testados o efeito de dois tipos de cultivo
individual (microgotas 20 μL e Cell Tak) na produção de embriões, o uso de ácido fólico
como antioxidante em diferentes concentrações (0, 10, 20, 50 e 500 µM) na produção
embrionária e no padrão de metilação de regiões do α- satélite e IGF2 e, o uso de ácido
fólico isolado ou conjugado com ITS durante o cultivo em sistema individual na produção
e qualidade dos embriões. Já no segundo foi determinada a quantidade relativa de RNAm
para os genes GPC4, PTGS2, LUM, ALCAM, FSHR, PGR, GPX3, SERPINE2, HAS2,
PRDX3, por PCR em tempo-real (qPCR) em biópsias de CC imaturas e maturadas. As
biópsias utilizadas para o qPCR foram agrupadas conforme o resultado da produção de
embriões em: CCOs que formaram blastocisto em D7(embrião); CCOs que não clivaram
(não clivado) e, CCOs que clivaram, mas que não chegaram a blastocisto (clivado). No
primeiro experimento, foi observado que o grupo Cell Tak apresentou menor taxa de
clivagem (P≤0,05) e menor produção de embriões (P≤0,05) em D7 e D8 em relação ao
grupo controle e microgotas de 20 μL. Em relação às diferentes concentrações de ácido
fólico, o grupo 500µM apresentou uma redução nas taxas de clivagem em D6 (P≤0,05)
em relação aos demais. Em D7, não houve diferença entre os grupos quando comparados
ao grupo controle. Em relação a metilação da região α- Satélite, os grupos Controle, 20
µM e 500 µM apresentaram padrão semelhantes (P>0,05), que era hipometilado. Já para
a região do éxon 10 do gene IGF2, o padrão de metilação foi diferente nos grupos 20 µM
e 500 µM em relação ao controle (P ≤0,05). Quanto ao uso de ácido fólico e ITS, isolados
ou associadosdurante o cultivo individual, foi observado que somente no grupo individual
na presença de ITS, produção de embriões foi semelhante ao cultivado em grupo
(P>0,05). No segundo experimento, dos 10 genes avaliados nas biópsias de CCs imaturas
e maturadas, 2 genes apresentaram diferenças no nível de RNAm entre os grupos. O gene
LUM mostrou-se mais expresso (P=0,02), enquanto que FSHR mostrou-se menos
expresso (P= 0,09), ambos em CC maturadas de CCOs que desenvolveram em embrião,
comparado as do grupo que não desenvolveu embrião. Conclui-se que o cultivo em gotas
na presença de ITS proporcionou as melhores taxas de embriões e, que apesar do ácido
fólico não afetar a produção altera o padrão de metilação do DNA. A expressão dos genes
LUM e FSHR, em CCs maturadas está associada a capacidade do ovócito de formar
embrião, podendo ser utilizados como marcadores não invasivos da competência
ovocitária.