Os objetivos desses experimentos foram avaliar os efeitos de uma segunda dose de prostaglandina F2α (PGF2α) em um protocolo de IATF à base de estradiol (E2) e progesterona (P4) na pulsatilidade de LH, características do folículo pré-ovulatório e prenhez por AI (P/AI) em vacas Holandesas em lactação em anestro. No experimento 1, 2.011 vacas Holandesas tiveram o ciclo estral sincronizado e os ovários escaneados por ultrassonografia para determinar se um corpo lúteo (CL) estava presente no momento do início do protocolo (d-12) e no dia da PGF2α (d-4) . As vacas sem CL em d-12 e d-4 foram classificadas como em anestro (n = 454) e submetidas ao seguinte protocolo de IATF: d -12 ou -11: dois dispositivos P4 intravaginais e benzoato de estradiol (EB); d -4 PGF2α e retirada de um dispositivo P4; d -2 cipionato de estradiol (ECP) e retirada do segundo dispositivo P4; no d 0, a IA foi realizado. No d -4, as vacas foram divididas aleatoriamente a um dos quatro tratamentos: uma dose de PGF2α em d -4 e 9 dias com um dispositivo P4 (1PGF9d, n = 116); duas doses de PGF2α, a primeira em d -4 e a segunda em d -2 e 9 dias com um dispositivo P4 (2PGF9d, n = 115); uma dose de PGF2α em d -4 e 10 dias com um dispositivo P4 (1PGF10d, n = 111) ou duas doses de PGF2α, a primeira em d -4 e a segunda em d -2 e 10 dias com um dispositivo P4 (2PGF10d, N = 112). A temperatura retal (TR) foi medida no d 0 e 7 e as vacas foram classificadas como TR abaixo (normotérmicas) ou acima de 39.0°C (hipertermica). A prenhez foi diagnosticada em d 30 e 58 após a AI. No experimento 2, 56 vacas Holandesas tiveram o ciclo estral sincronizado para iniciar o protocolo de IATF sem CL. Todas as vacas foram atribuídas a uma sincronização de protocolo à base de E2/P4. No d-11, as vacas foram bloqueadas pela produção de leite e paridade e divididas aleatoriamente para receber 1PGF, 5 mL de solução salina em d -2; ou 2PGF, uma segunda dose de 25 mg de dinoprost em d -2. O sangue foi colhido de d -11 a 0 para ensaiado de P4. Os cateteres foram colocados na veia jugular e o sangue foi colhido a cada 15 minutos a partir de 1 h antes a 6 h após os tratamentos, e a cada 2 h depois disso, durante 58 h. As amostras de plasma foram testadas quanto a concentrações de LH e metabolito de PGF2α (PGFM). O folículo pré-ovulatório foi aspirado em d 0 e o fluido foi analisado para E2 e P4. No experimento 1, o protocolo usando 9 ou 10 dias com dispositivo P4 não alterou P/AI aos 30 d (15,8 vs. 18,2%; P = 0,50) e 58 d (13,9 vs. 16,2%; P = 0,51). 2PGF aumentou (P = 0.04) a ovulação após a IA em todas as vacas (75.3 vs. 83.1%). Além disso, em vacas com TR ≤ 39,0, 2PGF aumentou (P < 0,03) P/AI em 58d em todas as vacas inseminadas (15,7 vs. 30,7%) ou apenas vacas sincronizadas (19,5 vs. 35,1%), mas não em vacas com TR > 39,0 (todas as vacas inseminadas, 10,0 vs. 9,5%, apenas vacas sincronizadas, 14,8 vs. 12,2%). No experimento 2, 2PGF reduziu (P = 0,05) o número de pulsos de LH /6 h (4,5 vs. 3,9 ± 0,2). O início do pico de LH, relativo ao tratamento, (22,4 vs. 19,3 ± 2,1 h), a hora em que o pico de LH foi detectado (29,0 vs. 28,0 ± 1,8 h) e magnitude do pico de LH (4,1 vs. 3,7 ± 0,3 ng / mL) não diferiu entre 1PGF e 2PGF, mas a duração do pico de LH foi maior (P = 0,04) para 2PGF do que 1PGF (13,1 vs 15,5 ± 0,8 h). As vacas que receberam 2PGF apresentaram maior (P = 0,05) diâmetro do folículo pré-ovulatório (12,3 vs. 14,4 ± 0,8 mm) com maior (P = 0,02) concentração de estradiol no fluido folicular em todos os folículos aspirados (115 vs. 262 ± 39 ng/mL) ou em folículos estrogênicos (161 vs. 372,8 ± 28 ng/mL). O tratamento com uma segunda dose de PGF2α melhora a P/IA em vacas anovulares normotérmicas devido ao aumento da ovulação e por melhorar as características do folículo pré-ovulatório.