Hipotetizamos que a insulina através de diferentes genes desempenhe um papel fundamental na regulação da esteroidogênese, e consequentemente nas funções das células luteínicas de cadelas não prenhes. Nosso objetivo in vivo foi mapear os genes diferencialmente expressos diretamente relacionados à cascata de sinalização insulínica e a esteroidogênese no CL canino, caracterizando sua expressão gênica e proteica no diestro. Além de caracterizar a via secundária de captação de glicose também decorrente da sinalização insulínica. Cadelas não gestantes foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia a cada 10 dias entre os dias 10 e 60 (n=5/grupo) após a ovulação. Os CL coletados foram utilizados para sequenciamento de RNA (RNA-Seq) e validação por PCR em tempo real, e proteica por Western blotting e imunofluorescência. Nos experimentos in vitro, identificamos a diferença de respostas das células luteínicas após estímulo insulínico sob a expressão dos genes relacionados à esteroidogênese encontrados diferencialmente expressos, e ainda realizamos o bloqueio das vias PI3K, MAPK14 e MAPK1/2 para mensuração da produção de esteroides (n=4/grupo). Foram identificados sete genes diferencialmente expressos relacionados à sinalização insulínica: o IRS1, PI3KR3, PI3KCG, MAPK9, MAPK13 e MAPK14 e SOCS1, além de dois genes, CYP19A1 e HSD3B, identificados como envolvidos com a esteroidogênese. A expressão de CYP19A1 encontra-se associada positivamente com a expressão de IRS1 (r = 0,6169 P= 0,0326) e negativamente com a expressão de MAPK9 (r =-0,8851 P= 0,0001) e SOCS1 (r =-0,6628 P= 0,0188). Enquanto HSD3B encontra-se associado positivamente com MAPK9 (r = 0,7889 P=0,0621), PI3KR3 (r =0,9906 P=0,0001) e SOCS1 (r =0,9534 P=0,0032), e negativamente com IRS1 (r = -0,9555 P=0,0003) e MAPK14 (r =-0,9541 P=0,0032). A via secundária de captação de glicose mostrou que CAP1, CrKII apresentaram aumento de sua expressão no período em que ocorre o aumento da produção de P4, diferente de RAP e RHOQ que apresentaram menor expressão gênica nos dias 40, coincidindo com o aumento de E2 no diestro. Nos experimentos in vitro, sob estímulo insulínico, a expressão de CYP19A1 não apresentou diferença quando as células eram provenientes do dia 20 (P=0.0682; r=0.5745), diferentemente do dia 40 (P= <0.0001; r=0.9655), no qual houve aumento de sua expressão no grupo tratado com insulina em relação ao controle. Em relação à expressão de HSD3B, houve aumento de sua expressão no dia 20 (P=<0.0001; r=1.0) e 40
(P=0.0042; r=0.7134). A produção de P4 pelas células luteinicas cultivadas apresentou diminuição de sua expressão com o bloqueio de PI3K (P=0.0026; r=0.8671), MAPK14 (P=0.0009; r=0.9072) e MAPK1/2 (P=0.0407; r=0.6493), enquanto que a produção do E2 apresentou diminuição nos bloqueios com PI3K (P=0.0008; r=0.9676) e MAPK14 (P=<0.0001; r=0.9902), e não houve diferença de produção com o bloqueio de MAPK1/2 (P=0.0704; r=0.4639). Em conjunto, estes dados sugerem que MAPK e PI3K podem modular a esteroidogênese no CL canino, provavelmente via expressão de HSD3B e CYP19A1. A ativação da via CAP-CrKII-RHOQ-RAP, não esta envolvida neste processo. Concluimos que a insulina é capaz de modular a esteroidogênese no CL canino e que a resposta hormonal ao estímulo insulínico depende do dia do diestro.