A Dermatite Digital (DD) é uma das principais doenças do sistema locomotor de bovinos que leva os animais a claudicação e apesar de bactérias do gênero Treponema serem consistentemente identificados em tecidos lesionados pela DD, a etiologia definitiva dessa doença polimicrobiana ainda não foi totalmente compreendida. Para tentar elucidar a etiologia dessa doença e suas possíveis rotas de transmissão dentro de uma propriedade leiteira, foram realizadas 37 biópsias de animais acometidos pela DD e foram coletadas 13 amostras de fluido ruminal e 13 amostras de fezes de vacas portadoras dessa lesão. Amostras ambientais de áreas específicas da propriedade também foram coletadas, como o material acumulado ao redor do bebedouro, pista de alimentação, sala de espera da ordenha, lava-pés e pedilúvio e para comparar o microbioma encontrado nas lesões com a pele sadia, foram realizadas três biópsias de pele íntegra localizadas adjacentes a lesão. Para análise dos microbiomas da DD e pele íntegra foram utilizadas as técnicas moleculares de Hibridização Fluorescente in Situ (FISH) e sequenciamento de nova geração e as amostras de fluido ruminal, fezes e ambiente foram analisadas pelo método de sequenciamento de nova geração. Foi encontrado pela técnica de FISH a presença bacteriana em 96,55% das lesões e as bactérias do gênero Treponema foram as mais frequentes, estando presentes em 93,55%. Já Dichelobacter nodosus estava presente em 58,06%; Fusobacterium necrophorum em 35,49% e Porphyromonas levii em 33,43%. As bactérias do gênero Treponema foram as que tiveram maior densidade nas amostras analisadas, seguidas por Dichelobacter nodosus; Fusobacterium necrophorum e Porphyromonas levii. Foram identificados sete filotipos diferentes nas amostras de DD: T. pedis, T. refringes, T. phagedenis, T. medium e alguns filotipos que não foram previamente cultivados e foram classificados nesse estudo como: PT18, PT13 e PT3, sendo T. phagedenis e T. pedis as espécies encontradas em maiores densidades nas lesões. Pela técnica de sequenciamento de nova geração os Treponemas estavam presentes em 68,6% das lesões, Porphyromonas em 91,4%, Mycoplasma em 85,7%, Helcococccus em 74,4%, Corynebacterium em 60%, Fusobacterium em 45,7%, Dichelobacter em 40%, e Alloiococcus em 17,1% e também foi encontrado filotipos que ainda não foram previamente identificados pela literatura. Nas amostras de fluido ruminal, fezes e ambiente foram encontrados Treponemas, mas em baixas proporções e dentre os Treponemas encontrados nesses locais os mais prevalentes ainda são desconhecidos pela literatura. Os dados encontrados nesse estudo apoiam o conceito de que a etiologia da DD é principalmente “multitreponemal” e polimicrobiana, onde vários agentes, podem agir sinergicamente com os Treponemas para causar a lesão de DD. As bactérias do gênero Treponema foram também encontradas no rúmen, fezes e amostras ambientais da propriedade, principalmente Treponemas que ainda não foram classificados pela literatura. Sugerindo que a microbiota do trato gastrointestinal e o ambiente da fazenda podem atuar como reservatórios de bactérias envolvidas na patogênese da DD. É necessária uma maior investigação sobre o real potencial da função do trato gastrointestinal como um reservatório para agentes patogênicos que levam ao desenvolvimento da lesão.