Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
VETERINÁRIA (42003016008P2)
Avaliação do teste platelia EIA® Aspergillus para diagnóstico da aspergilose em pinguins e interferência da contaminação ambiental
ANGELA LEITZKE CABANA
TESE
16/02/2017

A aspergilose é uma doença infecciosa não contagiosa causada por fungos do gênero Aspergillus, especialmente aqueles pertencentes à secção Fumigati e já foi descrita em diversas espécies, dentre elas os pinguins. As altas taxas de mortalidade atribuídas a esta doença, são decorrentes especialmente da dificuldade de realização de um diagnóstico precoce. Técnicas diagnósticas diretas para detecção do antígeno fúngico galactomanana (GM) em amostras clínicas têm sido utilizadas de modo crescente para o diagnóstico de aspergilose invasiva (AI) em humanos. A GM constitui-se de um polissacarídeo presente na parede celular de fungos do gênero Aspergillus. Embora sua aplicabilidade já esteja estabelecida para o diagnóstico precoce da AI em humanos, uma única testagem sérica por ELISA sanduíche a partir do kit comercial Platelia® Aspergillus EIA, deve ser interpretada com cautela, pois a técnica apresenta algumas limitações. Em animais sua aplicabilidade ainda não é bem elucidada. Com isso, o estudo objetivou avaliar a eficácia do teste Platelia EIA® Aspergillus para diagnóstico da aspergilose em pinguins e a influência da contaminação ambiental nos resultados do mesmo. Foram incluídas no estudo diagnóstico, amostras séricas de 29 pinguins de Magalhães que vieram a óbito por aspergilose (grupo caso) e 23 hígidos (grupo controle), as quais foram testadas a partir do kit para ensaio imunoenzimático tipo sanduíche em microplaca (Platelia Aspergillus EIA®, Bio-Rad) conforme as instruções do fabricante. Para o experimento de interferência ambiental foram utilizados 12 isolados de A. fumigatus da micoteca do Laboratório de Micologia da Faculdade de Medicina da FURG/FAMED incluindo cepas padrão, isolados clínicos de pinguins, humanos e isolados ambientais. Foram utilizadas para padronização do inoculo etapa de filtração, sedimentação, Pour-plate e espectrofotometria de acordo com CLSI, 2008. A detecção de GM foi realizada em três diluições sucessivas dos inoculos seguindo instruções do fabricante. Ao final foi calculado o índice de GM dividindo o valor da média da DO da duplicata da amostra (clínica ou da cepa testada) pelo valor da média da DO da duplicata da amostra de cut-off fornecida pelo kit. O índice de GM sérica não diferiu entre os animais do grupo caso e controle (pKW=0,097). A partir dos valores determinados pelas coordenadas da curva ROC, quatro diferentes pontos de corte (0,5, 1,0, 1,5 e 2,0) foram analisados, resultando em taxas de sensibilidade variando de 86,2% a 34,5%, e de especificidade entre 87% e 26,1%. Já na avaliação da interferência ambiental, a menor concentração de propágulos fúngicos de Aspergillus fumigatus capaz de gerar um resultado positivo foi de 480 conidios, sendo a concentração mediana de 4,8x103. Conclui-se que a detecção sérica de GM pelo teste Platelia Aspergillus EIA® não parece ser útil para o diagnóstico da aspergilose em pinguins naturalmente infectados, resultando em muitos falso-positivos. E, em relação a quantidade de conídios de A. fumigatus necessária para determinar resultado falso-positivo no teste de detecção de GM, evidenciou-se que há necessidade de uma maciça contaminação ambiental, por no mínimo 500 conídios, para que haja interferência no Platelia Aspergillus EIA®.

Aspergillus fumigatus;galactomanana;ELISA sanduíche;conídios
Aspergillosis is a non-contagious infectious disease caused by fungi of the genus Aspergillus, especially those belonging to the Fumigati section and has been describe in several species, among them penguins. The high mortality rates attributed to this disease are due in particular to the difficulty of performing an early diagnosis. Direct diagnostic techniques for the detection of galactomannan (GM) fungal antigen in clinical samples have been increase used for the diagnosis of invasive aspergillosis (AI) in humans. GM is a polysaccharide present in the cell wall of fungi of the genus Aspergillus. Although its applicability from the demonstration of circulating GM kinetics is already establish for the early diagnosis of AI in humans, a single serum test by Platelia® Aspergillus EIA should be interpreted with caution, since the technique has some limitations. In animals, its applicability is still not well understood. The objective of this study was to evaluate the effectiveness of the Platelia EIA® Aspergillus test for the diagnosis of aspergillosis in penguins and the influence of environmental contamination on the results. Serological samples of 29 Magellanic penguins that died of aspergillosis (case group) and 23 healthy (control group) were included in the diagnostic study, which were tested from the micro plate sandwich immunoenzymatic assay kit (Platelia Aspergillus EIA ®, Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions. For the environmental interference experiment, 12 isolates of A. fumigatus from the mycology laboratory of the FURG / FAMED School of Medicine including standard strains, clinical isolates of penguins, humans and environmental isolates were use. The filtration, sedimentation, Pour-plate and spectrophotometry steps was use to standardize the inoculum according to CLSI, 2008. GM detection was performing on three successive dilutions of the inoculums following the manufacturer's instructions. At the end, the GM index was calculated by dividing the mean OD value of the sample duplicate (clinical or strain tested) by the mean OD value of the duplicate cut-off sample provided by the kit. The serum GM index did not differ between the animals in the control and the case group (pKW = 0.097). From the values determined by the coordinates of the ROC curve, four different cutoff points (0.5, 1.0, 1.5 and 2.0) were analyzed, resulting in sensitivity rates ranging from 86.2% to 34, 5%, and specificity between 87% and 26.1%. In the evaluation of environmental interference, the lowest concentration of fungal propagates of Aspergillus fumigatus capable of generating a positive result was 480 conidia, with a median concentration of 4.8x103. It is conclude that the serum detection of GM by the Platelia Aspergillus EIA® test does not seem to be useful for the diagnosis of aspergillosis in naturally infected penguins, resulting in many false positives. And, in relation to the amount of A. fumigatus conidia required to determine false-positive results in the GM detection test for AI diagnosis, it was shown that the degree of environmental contamination capable of causing interference in the Platelia Aspergillus EIA® test Be robust, of about 500 conidia.
Aspergillus fumigatus;galactommanan;ELISA sanduich;conidia.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

SANIDADE ANIMAL
DIAGNÓSTICO, EPIDEMIOLOGIA E CONTROLE DAS DOENÇAS INFECCIOSAS E PARASITÁRIAS DOS ANIMAIS
Avaliação do teste Platelia Aspergillus EIA® para diagnóstico da aspergilose em pinguins e interferência da contaminação ambiental

Banca Examinadora

MARIO CARLOS ARAUJO MEIRELES
DOCENTE - PERMANENTE
Sim
Nome Categoria
ANA PAULA NEUSCHRANK ALBANO Participante Externo
PATRICIA DA SILVA NASCENTE Participante Externo
ALESSANDRO COMARU PASQUALOTTO Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Demanda Social 48

Vínculo

Colaborador
Instituição de Ensino e Pesquisa
Ensino e Pesquisa
Não