Contaminantes emergentes são substâncias potencialmente tóxicas, que estão presentes numa grande variedade de produtos como medicamentos, pesticidas e produtos de higiene e cuidado pessoal. São frequentemente detectadas no ambiente em concentrações-traço (ng.L-1 e µg.L-1),Nmas ainda não incluídas em programas de monitoramento. Entre essas substâncias destaca-seNo fármaco Diclofenaco, um anti-inflamatório não esteroide (AINE), frequentemente detectadoNem águas superficiais de todo mundo, sendo que a maioria dos estudos já realizadosNconcentram-se em ambientes de água doce. Nesse contexto, o presente trabalho realizou um estudo ecotoxicológico e uma avaliação de risco ambiental para o composto Diclofenaco na Baía de Santos, empregando uma abordagem escalonada (TIER) que envolve a determinação das concentrações ambientais em coluna d’água e dos efeitos biológicos adversos associados, considerando uma metodologia prevista pelo framework da União Europeia (EMEA CPMP/SWP/4447/00). No TIER 0 foram realizadas as análises químicas da água coletada no Emissário Submarino de Santos. No TIER I foi realizado o ensaio de fertilização. No TIER II, foram analisados os efeitos subletais. Os organismos foram expostos em três concentrações: 20 ng.L-1, 200 ng.L-1 e 2000 ng.L-1, durante 96h e os tecidos das brânquias e glândulas digestivas foram retirados para avaliação de biomarcadores (Citotoxicidade, EROD, DBF, GST, GPX, bem como Danos em DNA, Lipoperoxidação, AChE e COX). O Diclofenaco foi quantificado apenas em um ponto da superfície (20 ng.L-1). No ensaio de fertlização, a CE50 obtida foi de 388,52 mg.L-1 e no ensaio embriolarval a CI50 obtida foi de 18,92 mg.L-1. Efeitos negativos na estabilidade da membrana lisossômica foram observados em todas as concentrações testadas. A atividade da EROD foi inibida apenas na concentração de 200 ng.L- 1 e a DBF não sofreu nenhuma alteração significativa. As atividades das enzimas GST e GPx foram negativamente afetadas pelo Diclofenaco. Houve dano em DNA no tecido das glândulas apenas na maior concentração e a lipoperoxidação foi mais intensa no tecido das brânquias a partir da concentração de 200 ng.L-1, indicando estresse oxidativo. A atividade da AChE foi induzida no tecido das brânquias. Em relação à COX, houve uma significativa inbição da atividade a partir da concentração de 20 ng.L-1 no tecido das brânquias. A avaliação do risco empregando ensaios agudo e crônico normalizados indicou baixo risco ecológico na Baía de Santos. No entanto, os resultados demonstram que a concentração ambiental do fármaco, mesmo sendo da ordem de 20 ng.L-1 já é suficiente para provocar danos celulares e comprometimento fisiológico a partir da desestabilização da membrana lisossômica, corroborando com os dados de biomarcadores. Nossos resultados apontam para um risco ambiental na baía de Santos promovido pelo Diclofenaco e sugerem a necessidade de melhoria no tratamento de efluentes domésticos para redução desse composto, bem como regulamentação na legislação ambiental.