Brasil

Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Ciências e Biotecnologia (31003010079P0)
CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA E BIOQUÍMICA PARCIAL DA ASPARTIL PROTEASE PRESENILINASÍMILE DE L. chagasi
LUIZ ANDRE LUCAS TEIXEIRA PINTO
DISSERTAÇÃO
22/10/2012

A leishmaniose visceral é a principal causa de mortes por leishmaniose na Brasil e, no mundo afeta cerca de 12 milhões de pessoas. Como as drogas existentes causam diversos efeitos colaterais, a identificação de novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos fármacos é necessária. Neste estudo isolamos uma aspártico protease de membrana de Leishmania chagasi, que possui diversas características bioquímicas semelhante à presenilina (PS) humana. Em humanos esta proteína está descrita como sendo o componente catalítico de um complexo proteico denominado de gama-secretase e formas mutadas da PS estão associadas aos aparecimento da doença de Alzheimer. Estudos in silico forneceram somente a identificação da sequências similares da PS-simile e a Pen-2-símile de L. chagasi depositada em banco de dados, deixando de serem identificadas a nicastrina e a Aph-1. Portanto, nestes estudos nossos esforços se voltaram para caracterizar a PS de L. chagasi. A enzima de L. chagasi apresentou 31% de homologia presenilina humana e semelhança na posição dos aminoácidos do centro ativo, domínio PALP e ação de inibidores. Entretanto diferiu proteína humana no número de segmentos intramembranares. A PS de L. chagasi possui seis segmentos enquanto a humana nove. Para obtermos insumos necessários para uma caracterização mais fina da proteína, os epitopos B lineares da PS foram mapeados pela primeira vez. Empregamos a técnica de síntese paralela em membrana e soros de pacientes chagásicos. Seis epitopos IgG imunodominantes foram identificados e um foi selecionado para produção de anticorpos monoespecíficos em coelhos. A especificidade do antissoro foi avaliada por Immunoblotting e pela técnica de celluspot. Este antissoro identificou somente uma banda em extratos celulares, com peso molecular aparente de 50 kDa. Estudos de microscopia confocal e eletrônica demonstraram a presença da PS na membrana plasmática, membrana nuclear, membrana mitocondrial e flagelo. Este é o primeiro estudo descrevendo também a localização celular da PS em L. chagasi. Esta informação pode contribuir para o conhecimento de um novo mecanismo de processamento e maturação de proteínas membranares do parasito e fornecer ferramentas para investigar-se sua importância na relação parasito-hospedeiro como também da associação da presenilina de L. chagasi com o sistema macroautofágico.

caracterização;aspartil protease;enzima;anticorpos;leishmaniose
Visceral leishmaniasis is the major cause of death by Leishmaniasis in Brazil and in the world affects about 12 million people. The existing drugs cause various side effects; therefore the identification of new therapeutic targets for drug developing is required. In this study we isolated a membrane associated aspartic protease of Leishmania chagasi, which has several biochemical characteristics similar to human presenilin (PS). In humans, presenilin is associated with catalytic activity in a complex called gamma-secretase and mutated forms of this protein is associated with Alzheimer's disease. The application of bioinformatics tools provided the identification of the PS and Pen-2 sequences of L. chagasi deposited in the database, leaving being identified nicastrin and Aph-1. Therefore, these studies have turned our efforts to characterize the PS of L. chagasi. The enzyme of L. chagasi showed 31% homology with the human orthologous and similarity in amino acid position of the active center, PALP domain and inhibitors action. However, differed from the human enzyme in the number of intramembranar segments. The PS of L. chagasi has six segments while the human protein nine. To obtain inputs required for a finer characterization of the protein, the linear PS epitopes were mapped for the first time. We employed the parallel synthesis technique of peptides and sera from patients with Chagas disease. Six IgG immunodominant epitopes were identified and one was selected for production in rabbits monospecific antibodies. The specificity of the antiserum was assessed by immunoblotting and by the cellu-spot technique. This antiserum has identified only one band in cell extracts with apparent molecular weight of 50 kDa. Confocal and electron microscopy studies showed the presence of PS in the plasma membrane, nuclear membrane, mitochondrial membrane and flagella. This is also the first study describing the cellular localization of PS in L. chagasi. This information can contribute to the knowledge of a new processing engine and maturation of membrane proteins of the parasite and to provide tools to investigate its importance in the host-parasite relationship, since there is evidence of the association of the PS with the macrophagic process of Leishmaniasis.
characterization;aspartyl protease;enzyme;antibodies;leishmaniasis
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Contexto

CIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA - INTERAÇÕES MOLECULARES, CELULARES E SISTÊMICAS
A IDENTIFICAÇÃO DE PROTÓTIPOS BIOATIVOS E MOLÉCULAS DE IMPORTÂNCIA EM SISTEMAS BIOLÓGICOS E BIOTECNOLÓGICOS
BIOTECNOLOGIA DE PEPTÍDEOS E PROTEÍNAS: APLICAÇÕES ANTIMICROBIANAS E IMUNOLÓGICAS

Banca Examinadora

SALVATORE GIOVANNI DE SIMONE
Sim
Nome Categoria
HELENA CARLA CASTRO CARDOSO DE ALMEIDA Docente
DAVID WILLIAM PROVANCE JR Participante Externo
HERBERT LEONEL DE MATOS GUEDES Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
CONS NAC DE DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Bolsa Produtividade em Pesquisa 12

Vínculo

Bolsa de Fixação
Instituição de Ensino e Pesquisa
Pesquisa
Sim