Introdução: Quando ocorre aumento da osmolalidade ou diminuição do volume plasmático, os receptores hipotalâmicos estimulam a hipófise a secretar o hormônio antidiurético arginina vasopressina (AVP). Esse hormônio é reconhecido como o estimulador fisiológico da translocação da AQP2 de vesículas citoplasmáticas para o polo apical das células principais do ducto coletor, favorecendo o aumento da reabsorção de água, até que o equilíbrio osmótico seja alcançado. Além da AVP, já foi demonstrado que em células IMCD primárias, a Ang II também tem capacidade de modular a AQP2 e isso se dá através do receptor AT1 (AT1R), entretanto, não existem relatos sobre a capacidade da Ang-(1-7) de modular as AQP2.
Objetivos: O objetivo deste trabalho foi avaliar se Ang (1-7) e Ang II seriam capazes de translocar as AQP2 presentes em células LLC-PK1 transfectadas com AQP2 (LLC-PK1-AQP2) na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779, antagonistas de AT1R, AT2R e MasR respectivamente.
Materiais e Métodos: A presença das AQP1 e AQP2, da proteína recombinante e dos microfilamentos foram visualizadas por imunofluorescência. O mesmo método foi utilizado para a observação da translocação das AQP2 presentes nas células LLC-PK1-AQP2 antes e após tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A fosforilação das S256 e S261 das AQP2, foi analisada por Western Blotting em 2, 5, 15 e 30 minutos de tratamento com Ang-(1-7) e Ang II na presença ou ausência de Losartan, PD-123319 e D-Ala-A779. A modulação gênica, após estímulos a longo prazo, por 6, 12 e 24 horas com Ang-(1-7) e Ang II foi analisada por RT-PCR. Para análise estatística, foram utilizados testes one way Anova seguido de Dunnet’s multiple comparison test.
Resultados: Nosso estudo evidenciou: 1) Presença de vesículas de AQP1 e AQP2, tanto perinucleares quanto na membrana plasmática nas células LLC-PK1-AQP2 CT. 2) Presença de AQP2 recombinante na membrana plasmática de células estimuladas com AVP. 3) Mudança na organização dos microfilamentos em resposta a AVP, Ang-(1-7) e Ang II). 4) Ang-(1-7) e Ang II, foram capazes de translocar as vesículas de AQP2 do citoplasma para a membrana citoplasmática. 5) Pré tratamentos com Losartan, D-Ala-A779 e PD-123319, modularam a resposta da AQP2 e os níveis de fosforilação obtidas com Ang-(1-7) e Ang II. 6) Respostas gênicas para AQP2, foram estatísticamente significante nos tratamentos de 6 h com AVP e em 24h com Ang-(1-7).
Conclusões: 1) Pela primeira vez, foi demonstrado que a Ang-(1-7) é capaz de induzir a translocação das AQP2 de vesículas citoplasmáticas para a membrana plasmática. 2) A Ang-(1-7), parece ter um efeito mais efetivo sobre o aumento na fosforilação S256 e diminuição na fosforilação da S261 das AQP2, do que a Ang II. 3) Houve reorganização dos microfilamentos de actina após estímulo com AVP, Ang-(1-7) e Ang II sugerindo que esses microfilamentos são importantes no direcionamento das vesículas de AQP2. 4) A inibição prévia com Losartan, D-ALA-(A779) e PD-123319 evidenciaram que Ang-(1-7) e Ang II podem atuar através de outros receptores além dos específicos, sugerindo a formação de dímeros ou oligômeros entre esses receptores. 5) A mistura dos três antagonistas, bloqueou totalmente a translocação da AQP2. 6) A Ang-(1-7) aumentou a expressão gênica de AQP2 em 24h, sugerindo ser um indutor gênico tardio, comparado à AVP.