A rutina é um flavonoide e seu potencial antioxidante já foi demonstrado em diferentes tipos celulares. Entretanto, ainda não há informações sobre o efeito antioxidante da rutina no cultivo in vitro de folículos secundários ovinos. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da rutina como único suplemento antioxidante, adicionado ao meio de base, sobre o cultivo in vitro de folículos secundários isolados de ovários ovinos. Folículos secundários (n= 55-61) ovinos, com diâmetro em torno de 200 μm, foram cultivados individualmente em gotas de 100 μL, durante 12 dias, à 39°C, em α-Meio Essencial Mínimo (α-MEM) suplementado com 3,0 mg/mL BSA, 10 ng/mL insulina, 2 mM glutamina e 2 mM hipoxantina (meio livre de antioxidantes, denominado de α-MEM) ou neste mesmo meio adicionado ainda de 5,5 μg/mL transferrina, 5,0 ng/mL selênio e 50 μg/mL ácido ascórbico (AO). Para avaliar o efeito antioxidante da rutina, aos diferentes meios de base, com ou sem antioxidantes (α-MEM ou AO), foram adicionados diferentes concentrações de rutina (0,1; 1 ou 10 μg). A cada 6 dias, os folículos foram avaliados quanto aos aspectos morfológicos (folículos normais, formação de antro e diâmetro folicular). Ao final do cultivo, determinou-se a percentagem de oócitos totalmente crescidos (oócitos >110 μm). Nos tratamentos que obtiveram os melhores resultados de morfologia, foram avaliados a viabilidade folicular, através dos marcadores fluorescentes calceína-AM e etídio-homodímero 1, apoptose folicular através da técnica de TUNEL e os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigênio (EROs), glutationa (GSH) e mitocôndrias ativas. As taxas de folículos normais, formação de antro, viabilidade e oócitos >110 μm foram comparadas pelo Qui-quadrado. Os dados de diâmetro folicular, taxa de crescimento, foram submetidos ao Shapiro-Wilk seguido do teste de Kruskal-Wallis; e comparados pelo Student Newman Keuls. A apoptose foi avaliada pelo teste de Fisher. Níveis de EROs, GSH e mitocôndrias ativas foram submetidos a ANOVA (P<0,05). Os resultados mostraram que após 12 dias de cultivo, os meios AO e α-MEM (sem antioxidante) acrescido de 0,1 μg de rutina apresentaram porcentagens de folículos normais superiores (p<0,05) quando comparados aos demais tratamentos. Não houve diferenças (p>0,05) no diâmetro e na taxa de crescimento. Além disso, AO e α-MEM acrescido de 0,1 μg de rutina apresentaram porcentagem de viabilidade folicular, formação de antro, oócitos totalmente crescidos, níveis de EROs e mitocôndrias ativas semelhantes (p>0,05). No entanto, o tratamento α-MEM adicionado de 0,1 μg de rutina apresentou níveis de GSH superiores quando comparado ao AO. Em conclusão, na concentração de 0,1 μg, a rutina pode ser utilizada como o único antioxidante presente no meio de base para o cultivo in vitro de folículos secundários ovinos, mantendo a viabilidade folicular e aumentando os níveis de GSH.