Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL (33009015034P6)
PVALB: ANÁLISE DO EFEITO DA EXPRESSÃO ECTÓPICA EM LINHAGENS DE CARCINOMA DA TIROIDE
THAIS BIUDE MENDES
DISSERTAÇÃO
31/03/2016

O gene PVALB foi identificado pelo nosso grupo como um marcador de benignidade capaz de auxiliar o diagnóstico diferencial dos nódulos da tiroide, pois sua expressão encontra-se aumentada nos adenomas de Células de Hürthle (ACH), mas foram consistentemente negativas nos casos de Carcinomas Foliculares da Tiroide (CFT) Carcinomas de Células de Hürthle (CCH) e carcinomas papilíferos da Tiroide (CPT). O gene PVALB codifica uma proteína quelante de cálcio (Ca2+), cujo papel na gênese dos tumores da tiroide é desconhecido. Neste estudo, propomos caracterizar o papel de PVALB na patogênese dos tumores da tiroide. Para isso, o gene PVALB foi clonado em vetor de expressão fusionado a tag HA (HA-PVALB). Após transfecção permanente do vetor em duas linhagens celulares derivadas de carcinoma folicular da tiroide (WRO e FTC-133), e que não apresentam expressão endógena deste gene, avaliamos os efeitos biológicos e bioquímicos da expressão de PVALB nestas células. Utilizando indicadores específicos de Ca2+ livre Fluo-4, AM (citoplasma) e Rhod-2, AM (mitocôndria), avaliamos o fluxo de cálcio intracelular, após tratamento com tapsigargina, um inibidor seletivo da Ca2+-ATPase do retículo (SERCA). Posteriormente, avaliamos a morfologia das células por Microscopia Eletrônica de Transmissão. Para o potencial de membrana mitocondrial e a distribuição celular das mitocôndrias bem como a massa mitocondrial, utilizamos marcador fluorescente (MitoTracker red CMXRos). As imagens foram avaliadas por microscopia confocal. Também avaliamos os efeitos da expressão ectópica de PVALB nas taxas de proliferação, apoptose e senescência celular. Os níveis de proteínas de possíveis vias de sinalização relacionadas ao efeito biológico da expressão de PVALB foram analisadas por Western Blot. Posteriormente verificamos se a expressão de PVALB, nas amostras de tumores da tiroide está correlacionado com depósito de cálcio na células tumorais. Observamos que PVALB reduz as taxas de Ca2+ livre no citoplasma e na mitocôndria das células WRO. PVALB promove alteração no tamanho das células e na morfologia, número e distribuição das mitocôndrias no citoplasma das da células WRO e FTC-133. Além disso, a expressão de PVALB induziu a expressão de proteínas associadas ao estresse de retículo, bem como, reduziu a expressão de proteínas associas a via PI3K/AKT. Estes dados explicam, em parte, o efeito de PVALB na redução das taxas de proliferação celular e um aumento nas taxas de apoptose ou senescência. Ainda a expressão de PVALB está correlacionada com a presença de cálcio nas amostras de ACH, confirmando nossos resultados obtidos in vitro. Os dados sugerem que PVALB pode atuar como um gene supressor tumoral. A perda da expressão de PVALB nos carcinomas de tiroide pode representar um importante mecanismo associado a gênese e/ou progressão dos tumores da tiroide, especialmente os CCH.

1. Neoplasias da Glândula Tireoide. 2. Cálcio. 3. Glândula Tireoide.
Our group identified a panel of molecular markers (C1orf24, ITM1 and PVALB) that can accurately distinguish between benign and malignant thyroid lesions. Despite the fact that the identification of these new markers may ultimately help patient care, the current understanding of their biological functions remains largely unknown. PVALB stains specifically the benign Hürthle cell adenoma (HCA), while tests negative in a wider variety of thyroid carcinomas including Hürthle cell carcinoma (HCC). As its expression is lost during tumor progression, in this study we ectopically expressed PVALB in two thyroid carcinoma cell lines (FTC-133 and WRO) and dissected the mechanism underlying the phenotypic changes commonly observed in Hürthle cell tumors. We demonstrated that PVALB sequesters free cytoplasmic Ca2+, which ultimately lowers calcium levels and precludes endoplasmic reticulum (ER) Ca2+ refilling, therefore, inducing ER stress through PERK signaling, as well as compromising the flow of Ca2+ into the mitochondria. By investigating mitochondrial morphology and membrane potential, we demonstrated that PVALB promotes an increase in mitochondrial mass and cell size, in parallel with changes in mitochondrial morphology. Furthermore, PVALB ectopic expression diminished cell proliferation rate and induced cell death through the AKT/GSK-3β pathway. We further demonstrated by immunohistochemistry that PVALB expression colocalizes with the presence of Ca2+ in HCA samples and, therefore, our in vitro results show striking similarities with the results obtained from the analysis performed in Hürthle tumors sections. In summary, PVALB plays a role in cellular calcium homeostasis, ER stress and cell death, most likely related to its role in mitochondrial dynamics. These data support the hypothesis that the loss of PVALB plays a role in the progression of thyroid tumors, predominantly in HCC, and therefore, it may act as a tumor suppressor gene.
1. Thyroid Neoplasms. 2. Calcium. 3. Gland Thyroid.
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
O trabalho não possui divulgação autorizada

Contexto

GENÉTICA
GENÉTICA E EPIGENÉTICA DO CÂNCER
Identificação e caracterização funcional dos genes ou vias de ativação associados a tumores da tiróide humana

Banca Examinadora

JANETE MARIA CERUTTI
Sim
Nome Categoria
CAROLINA PRADO DE FRANCA CARVALHO Participante Externo
PAULO LUIZ DE SA JUNIOR Participante Externo
SILVIA REGINA CAMINADA DE TOLEDO Docente

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
CONS NAC DE DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Bolsa no país - Pós-graduação 24

Vínculo

Colaborador
Instituição de Ensino e Pesquisa
Ensino e Pesquisa
Não