Governo Federal

Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
MEDICINA (UROLOGIA) (33009015021P1)
Influência da fragmentação do DNA espermático murino no perfil metabolômico do meio de cultura de embriões em estágio de blastocisto.
THAIS CAROLINE GARCIA AGUIAR SANTOS
DISSERTAÇÃO
30/09/2015

Introdução: Os espermatozoides que carregam fragmentação de DNA são capazes de alcançar a fertilização, o que representa uma preocupação sobre a transmissão do material genético anormal aos descendentes, visto que níveis altos dessa fragmentação estão relacionados com baixa qualidade dos embriões e aborto espontâneo. Portanto, a utilização de um modelo experimental com integridade de DNA espermático diminuída é necessária para compreender o impacto da qualidade do DNA no desenvolvimento embrionário. Objetivo: Analisar a influência da fragmentação do DNA de espermatozoides murinos na metabolômica do meio de cultura embrionário. Métodos: Camundongos machos FVB/NJ de 8 a 12 semanas foram divididos em dois grupos: com baixa fragmentação de DNA (Grupo Controle) e com alta fragmentação de DNA induzida por estresse térmico (Grupo Estresse Térmico), realizado através da submersão do saco escrotal em água a 40°C durante 30 minutos. Camundongos fêmeas C57BL/6J de 3 a 4 semanas foram superovuladas e geraram embriões por concepção natural com os machos dos diferentes grupos. Os espermatozoides de ambos os grupos foram coletados de duas regiões: epidídimo do macho e útero da fêmea logo após o acasalamento, e foi avaliada a concentração, motilidade e fragmentação de DNA desses espermatozoides através do ensaio cometa. Os embriões foram coletados no estágio de 2 células e cultivados até blastocisto, quando o meio de cultura foi coletado e armazenado a -80°C para posterior análise pela técnica de Ionização e Dessorção a Laser por Matriz Assistida (MALDI-TOF MS) em modo positivo. O desenvolvimento embrionário foi acompanhado durante o cultivo. Realizou-se a análise de componentes principais, análise discriminante pelos quadrados mínimos e os 15 íons com maior representatividade foram identificados pela importância da variável na projeção. Resultados: Não foi observada diferença estatística quanto à concentração e motilidade dos espermatozoides murinos nos diferentes grupos e nas diferentes regiões de coleta. Foi comprovado que os espermatozoides submetidos ao estresse térmico testicular apresentam maior fragmentação de DNA em ambas as regiões comparadas ao grupo controle. Não houve diferença estatística quanto à taxa de cruzamento, fertilização e desenvolvimento embrionário entre os grupos. Na análise metabolômica do meio de cultura foram identificados ácidos graxos, esteroides, esfingosina, modulador seletivo de receptor de estrogênio, prostaglandinas, leucotrienos, onoacilglicerofosfocolina, monoacilglicerofosfoetanolamina e agonista de receptor canabinóide hiper-representados no grupo controle. Conclusão: A fragmentação do DNA do espermatozoide murino modifica o perfil metabolômico do meio de cultura do embrião até o estágio de blastocisto, entretanto não altera o seu desenvolvimento embrionário in vitro.

hipertermia induzida;fragmentação de DNA;espermatozoide;metabolômica;desenvolvimento embrionário;blastocisto
Introduction: The sperm with DNA fragmentation are able to achieve fertilization, representing a concern about the transmission of abnormal genetic material to offspring, since high levels of this fragmentation are related to low quality of embryos and spontaneous abortion. Therefore, the use of an experimental model with reduced sperm DNA integrity is necessary to understand the impact of the DNA quality in embryonic development. Objective: Analyze the influence of murine sperm DNA fragmentation in the metabolomics of the embryo culture medium. Methods: Male FVB/NJ mice aged 8-12 weeks were divided into two groups: with low DNA fragmentation (Control Group) and with high DNA fragmentation induced by heat stress (Heat Stress Group), which was done by submerging the scrotum in water at 40°C during 30 minutes. Mice females C57BL/6J aged 3-4 weeks were superovulated and generated embryos by natural conception with males from the two different groups. The sperm of both groups were collected from two regions: male epididymis and female uterus after mating, and it was evaluated the sperm count, motility and sperm DNA fragmentation by comet assay. The embryos were collected in 2-cell stage and cultured until the blastocyst stage, when the culture medium was collected and stored at -80ºC for further analysis by Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI-TOF MS) in positive mode. The embryo development was followed during the cultive. Statistical analysis was performed using Principal Component Analysis (PCA) and Partial Least Squares – Discriminant Analysis (PLS-DA), and the 15 most representative ions were identified by the variable importance in projection scores (VIP). Results: There was no statistical difference in the sperm count and motility in different groups and different regions of collection. It was proven that the sperm submitted to testicular heat stress have higher DNA fragmentation in both regions compared to the control group. There was no statistical difference in mating rate, fertilization and embryonic development between the groups. The analyse of culture medium metabolomics were identified fatty acids, steroids, sphingosine, selective estrogen receptor modulators, prostaglandins, leukotrienes, monoacylglycerophosphocholine, monoacylglycerophosphoethanolamine and cannabinoid receptor hyper-represented in the control group. Conclusion: The murine sperm DNA fragmentation changes the metabolomic profile of the embryo culture medium until the blastocyst stage, however does not change the embryonic development in vitro.
induced hyperthermia;DNA fragmentation;sperm;metabolomics;embryo development;blastocist
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Contexto

REPRODUÇÃO HUMANA E ANDROLOGIA
ESTUDO DO DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO, DE CÉLULAS-TRONCO EMBRIONÁRIAS E MESENQUIMAIS E DE CÉLULAS DE PLURIPOTÊNCIA INDUZIDA
Influência da fragmentação do DNA espermático murino no estresse oxidativo e no perfil metabólico do meio de cultura de embriões em estágio de blastocisto.

Banca Examinadora

EDSON GUIMARAES LO TURCO
Não
Nome Categoria
HELOISA ALLEGRO BAPTISTA Participante Externo
MARCILIO NICHI Participante Externo
RICARDO PIMENTA BERTOLLA Docente

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Programa de Demanda Social 24

Vínculo

CLT
Empresa Privada
Profissional Autônomo
Não