Os caracteres morfológicos têm sido tradicionalmente utilizados na taxonomia para identificar espécies. No entanto, a abordagem morfológica apresenta limitações intrínsecas, principalmente pela dificuldade em detectar espécies crípticas. Em vista disso, o uso da taxonomia integrativa tem se expandido nos últimos anos e permite integrar todas as fontes de dados disponíveis para avaliar a real diversidade de um grupo. Nesse contexto, o presente estudo teve por objetivo avaliar a diversidade do gênero Nematocharax (Characiformes, Characidae), que possui apenas uma espécie válida (N. venustus), por meio de marcadores cromossômicos, moleculares e morfométricos, a fim de auxiliar na taxonomia do grupo. As análises foram realizadas em sete populações das bacias do rio de Contas, Almada e Jequitinhonha. Os dados citogenéticos revelaram uma macroestrutura cariotípica conservada em todas as populações, com número diplóide igual a 50, fórmula cariotípica composta por 8m+26sm+14st+2a e número fundamental igual a 98, independentemente do sexo ou localidade. Entretanto, foi observada uma considerável variação na distribuição de sequências repetitivas, especialmente em relação ao DNAr 5S, e marcadores cromossômicos específicos para cada população foram identificados. De acordo com a análise das sequências do gene mitocondrial Citocromo C Oxidase Subunidade I (COI) pela técnica de DNA barcode, as divergências interpopulacionais variaram entre 0 e 7,5% e quatro grupos foram suportados por valores de bootstrap ≥ 99% na árvore de Neighbor-Joining. Adicionalmente, diferenças morfométricas foram encontradas entre as populações, principalmente associadas à altura do corpo, altura e comprimento da cabeça e diâmetro do olho. A população do Alto Contas foi a que mais divergiu tanto nos dados morfométricos quanto genéticos, sugerindo a presença de uma nova espécie de Nematocharax que pode ter se estabelecido na região do Alto rio de Contas após o soerguimento da Chapada Diamantina. Fatores como seleção sexual, ciclo de vida rápido, taxa de dispersão restrita e isolamento das bacias podem estar contribuindo para a rápida divergência evolutiva entre as populações. Assim, os dados evidenciam a presença de unidades evolutivas únicas em N. venustus e a possível presença de um conjunto de formas crípticas. Adicionalmente, demonstra-se que as bacias da região hidrográfica do Atlântico Leste, fortemente alteradas pelas ações antrópicas, constituem áreas prioritárias para a conservação biológica.