Brasil

Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Ciências e Biotecnologia (31003010079P0)
ESTUDO TRANSLACIONAL: ATIVIDADE DE PROTEASES E CITOCINAS INDUTORAS DE NEUROINFLAMAÇÃO EM PACIENTES COM GLIOBLASTOMA RECIDIVO E INFLUÊNCIA DO MICROAMBIENTE NAS CÉLULAS DA LINHAGEM U87MG DE GLIOBLASTOMA HUMANO
ANGELICA LAURIA DO NASCIMENTO MELLO
DISSERTAÇÃO
15/04/2015

Introdução: Glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor maligno do sistema nervoso central com marcante instabilidade no genoma das células gliais. Proteases e citocinas produzidas no microambiente tumoral influenciam na neovascularização, proliferação, invasividade e progressão tumoral. Objetivo: Analisar a produção e atividade das proteases MMP-2, MMP-9, e citocinas proinflamatórias uPAR, MMP-9/TIMP-1, MIF, MIP-1ɑ e IFN-γ em pacientes com GBM recidivo, e verificar a influência de mudanças no microambiente na atividade da linhagem de glioma humano U87MG. Material e Métodos: A coorte incluiu 137 indivíduos adultos com GBM recidivo em estágio terminal incluídos no Estudo Fase I/II de tratamento com o monoterpeno álcool perílico (POH). Os pacientes foram grupados de acordo com a classificação (GBM primário: n= 94 e secundário: n= 43) e localização da lesão tumoral (lobar: n= 59 e profunda: n= 13). A atividade das gelatinases foi determinada por zimografia e a concentração circulante de mediadores proinflamatórios uPAR, MMP-9/TIMP-1, MIF, MIP-1ɑ e IFN-γ por ELISA em amostras de soro. A linhagem U87MG de GBM humano foi utilizada nos ensaios in vitro para verificar a influência de alteração no microambiente na viabilidade celular (MTT), proliferação celular com CFSE (citometria de fluxo), migração celular (scratch assay), ativação celular (fosforilação pERK1/2) e apoptose (Bcl-2) por western blot. Análise estatística utilizou teste-T não pareado de Welch e teste-F para determinar diferenças entre grupos considerando nível de significância p<0,05. Resultados e Discussão: Independente da classificação e localização da lesão tumoral não se observou diferença significativa na atividade das gelatinases MMP-2, MMP-9, nem na concentração circulante de MMP-9/TIMP-1, uPAR e citocinas com atividade proinflamatória e proangiogênica (MIF, MIP-1ɑ e IFN-γ) apesar de ser notado uma evidente heterogeneidade desses marcadores nos pacientes com GBM. Análise em amostras coletadas em diferentes tempos mostrou relação direta entre o aumento na atividade das MMPs e uPAR com recidiva tumoral e resposta ao tratamento com POH. Ensaios in vitro mostraram que alteração no microambiente com matrigel, causou sincronização das células U87MG para fase G0/G1 do ciclo celular, aumentou a proliferação celular, a atividade da gelatinase MMP-2; a invasividade e ativação celular com aumento de pERK-2, mas sem ativação de Bcl-2. Conclusão: Após a recorrência tumoral os pacientes com GBM apresentam padrão de neuroinflamação semelhante independente da classificação histológica e/ou localização da lesão. O tratamento com POH reduziu a neuroinflamação e aumentou a sobrevida. O estudo in vitro indicou que alteração no microambiente com matrigel sincroniza e aumenta a proliferação, a ativação e invasividade de células U87MG. Em conjunto o estudo ressalta a importância de se considerar a classificação molecular do GBM além da classificação histológica nos estudos visando estabelecer o papel de fatores da neuroinflamação e proangiogênicos na fisiopatologia do GBM.

Glioblastoma Multiforme, Metaloproteases, Uroquinase Ativadora do Plasminogênio, Citocinas, Neuroinflamação, Matriz Extracelular
Introduction: Glioblastoma multiforme (GBM) is a malignant tumor of the central nervous system that presents marked glial cell genome instability. Proteases and cytokines produced within the tumor microenvironment are important for neovascularization, proliferation and by influencing progression and glioma invasiveness. Objective: To determine the production and activity of proteases MMP-2, MMP-9, and proinflammatory cytokines uPAR, MMP-9/TIMP-1, MIF, MIP-1ɑ and IFN-γ of patients with recurrent GBM, and verify the influence of changes within the microenvironment of cell culture on the activity of U87MG human glioma cell line. Material and Methods: The cohort included 137 adult subjects with recurrent GBM at terminal stage enrolled on the Phase I/II clinical trial for intranasal treatment with the monoterpene perillyl alcohol (POH). Patients were grouped according to tumor classification (primary GBM: n= 94 and secondary GBM: n= 43) and tumor lesion topography (lobar: n= 59 and deep: n= 13). Gelatinase activity was determined by zymography, and circulating serum levels of proinflammatory substances uPAR, MMP-9/TIMP-1, MIF, MIP-1ɑ e IFN-γ by ELISA. U87MG human GBM cell line was used for in vitro assays to assess the influence of the microenvironment on cell viability (MTT assay), cell proliferation with CFSE (flow cytometry) cell migration (scratch assay), and cell activation (pERK1/2 phosphorylation) and apoptosis (Bcl-2) by western blot analysis. For statistical analysis it was used unpaired Welch T-test and F-test to determine differences among groups considering significance level of p<0.05. Results and Discussion: Regardless tumor classification and lesion topography it was not observed significant difference of MMP-2 and MMP-9 activities, MMP-9/TIMP-1, uPAR and proinflammatory/proangiogenic cytokine (MIF, MIP-1ɑ e IFN-γ) circulating levels. Yet, it was notice a clear heterogeneity among GBM groups. Sample analyses collected at different time of POH treatment indicated a straight correlation between increased MMPs activity and uPAR production with tumor recurrence and response to POH. In vitro assays further showed that change in the U87MG cell culture microenvironment with matrigel synchronized cell cycle to G0/G1 phase, increased cell proliferation, MMP-2 activity. In addition matrigel promoted cell invasiveness and activation by increasing pERK-2 levels but not Bcl-2 level. Conclusion: After tumor recurrence GBM patients present similar pattern of neuroinflammation independent of histological classification and tumor lesion topography. POH treatment reduced neuroinflammation and increased survival. In vitro assays indicated that the microenvironment influences U87MG characteristics. Modification with matrigel synchronized and increased cell proliferation, activation and invasiveness. Altogether the results indicated relevant to consider also the molecular classification besides GBM histology for studies assessing the role of neuroinflammation and proangiogenic factors in the GBM physiopathology.
Glioblastoma Multiforme, Metalloproteases, Urokinase Plasminogen Activator, Cytokines, Neuroinflammation, Extracellular Matrix
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PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Contexto

CIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA - INTERAÇÕES MOLECULARES, CELULARES E SISTÊMICAS
A IDENTIFICAÇÃO DE PROTÓTIPOS BIOATIVOS E MOLÉCULAS DE IMPORTÂNCIA EM SISTEMAS BIOLÓGICOS E BIOTECNOLÓGICOS
ESTUDO DE MARCADORES BIOLÓGICOS DA NEUROINFLAMAÇÃO E DE ALTERAÇÕES MOLECULARES ASSOCIADOS COM A PROGRESSÃO CLÍNICA DOS GLIOMAS E COM O EFEITO DO ÁLCOOL PERÍLICO

Banca Examinadora

THEREZA FONSECA QUIRICO DOS SANTOS
Não
Nome Categoria
SHEILA ESPIRITO SANTO ARAUJO Participante Externo
ALEXANDER SIBAJEV Participante Externo
ANDREA ALICE DA SILVA Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUND COORD DE APERFEICOAMENTO DE PESSOAL DE NIVEL SUP - Professor Visitante 24
FUNDACAO CARLOS CHAGAS FILHO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO-FAPERJ - Apoio a Pós-Doutorado 12

Vínculo

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Não