Brasil

Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
Ciências e Biotecnologia (31003010079P0)
“Normalização de Testes de Citotoxidade para Cultivo Celular em Agregados Tridimensionais”
ROBER FREITAS BACHINSKI
TESE
02/03/2015

A citotoxicidade é o primeiro parâmetro utilizado para estimar doses tóxicas para extrapolações in vitro para in vivo ou para estimativa de doses que não sejam tóxicas para análise de desfechos complexos, economizando custos e tempo e trabalhando na susbtituição do uso de animais para varredura de novos químicos, qualidade de produto e processos biotecnológicos. Modelos 3D de agregados aumentam as interações entre células e as interações células e matriz extracelular, simulando melhor o meio ambiente in vivo. Porém, testes de citotoxicidade em modelos 3D requerem protocolos padronizados. O presente trabalho tempor objetivo avaliar o melhor teste de citotoxicidade para um modelo de agregado de cultivo celular padronizado. Agregados de LUHMES diferenciados são empregados para análises métricas e para normalização medição e normalização dos testes de citotoxicidade usando curva de exposição a SDS e teste de quantificação de DNA (teste de eluição dos corante crsital violeta e quantificação do Hoechst 33342), Teste da enzima Lactato desidrogenase, atividade metabólica (conversão da resazurina em resufurina), captação de vermelho neutro e estimativa da densidade celular em cada agregado após a dissociação. Os testes de resazurina e NRU mostratram as melhores correlações com o diâmetro dos agregados (0.8634 e 0.7337, respectivamente). As curvas de citotoxicidade analisadas por NRU, Resazurina e LDH possuem o mesmo padrão da curva de recomendação do protocolo 129 da OECD. A curva de estimativa de células mostrou uma boa correlação (0,7869) da curva de crescimento exponencial com o volume do agregado. A quantificação de DNA não foi considerada um bom parâmetro de citotoxicidade em modelo 3D. Os testes de Resazurina e LDH se mostraram métodos efetivos para os estudos de avaliação da citotoxicidade, com alta reprodutibilidade e sensitividade, sendo considerado adequado para análise de citotoxicidade em modelo tridimensional de agregado celular.

Viabilidade Celular, Alternativas aos Testes em Animais, Engenharia de Tecidos.
Cytotoxicity is the first parameter for estimating the toxic doses for in vitro/in vivo extrapolations or estimating non-toxic doses for complex endpoints thus saving costs and time and working on the replacement of animal use for screening of new chemicals, product quality and biotechnology processes. Aggregate 3D models increase cell/cell and cell/matrix interactions, better simulating in vivo environment. However, cytotoxicity assays in 3D models require standardized protocols. The present work aimed to evaluate the best cytotoxicity test for a standardized aggregate cell culture model. Differentiated LUHMES aggregates were employed for metric and normalization analyses and cytotoxicity assays using either SDS curve for DNA quantification test (crystal violet dye elution test and Hoechst 33342 quantification), Lactate dehydrogenase test, metabolic activity (resazurin/resufurin), neutral red uptake and estimation of cell density in each aggregate after dissociation. Resazurin and NRU showed the best correlations with aggregate diameter (0.8634 and 0.7337 respectively). The NRU, Resazurin and LDH cytotoxicity curve had the same pattern of 129 OECD recommendations. The curve for estimating the number of cell showed a good correlation (0.7869) in the exponential growth curve by aggregate’s volume. DNA quantification was not considered a good parameter for cytotoxicity in 3D models. Resazurin and LDH assays were the most effective methods of the ones studied for cytotoxicity assessment, with high repeatability and sensitivity, being considered adequate for toxicological assessments with tridimensional aggregate models.
Cell Survival, Animal Testing Alternatives, Tissue Engineering
01
74
PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE

Contexto

CIÊNCIAS E BIOTECNOLOGIA - INTERAÇÕES MOLECULARES, CELULARES E SISTÊMICAS
ANÁLISE MOLECULAR, CELULAR E/OU SISTÊMICA DE PROCESSOS BIOLÓGICOS E BIOTECNOLÓGICOS
Desenvolvimento, avaliação e validação de métodos alternativos em desenvolvimento biotecnológico

Banca Examinadora

GUTEMBERG GOMES ALVES
Não
Nome Categoria
HELENA CARLA CASTRO CARDOSO DE ALMEIDA Docente
SAULO CABRAL BOURGUIGNON Docente
LIDIA MARIA DA FONTE DE AMORIM Docente
Thomas Hartung Participante Externo
ESTHER RIEKO TAKAMORI Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
CONS NAC DE DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLOGICO - Apoio a Projeto de Pesquisa - Universal 14/2012 24
FUNDACAO CARLOS CHAGAS FILHO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO-FAPERJ - Edital FAPERJ Nº 13/2012 - Programa Apoio à Manutenção de Equipamentos Multiusuários 24

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