Governo Federal

Dados do Trabalhos de Conclusão

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
MICROBIOLOGIA E IMUNOLOGIA (33009015003P3)
Caracterização de amostras de Escherichia coli do sorotipo O119:H6 que co-expressam os padrões de adesão localizada e agregativa e produzem biofilme
BRUNA GIL GARCIA
TESE
30/09/2014

Amostras de Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC) carreiam o plasmídio EAF que codifica a Bundle forming pilus (BFP), promovem lesão attaching/effacing e produzem adesão localizada (AL) em células HeLa. EPEC do sorotipo O119:H6 que produzem AL (AL+) são frequentes em nosso meio, porém, isolamos algumas EPEC O119:H6 que produzem AL e adesão agregativa (AA) concomitantemente (AL/AA+). Curiosamente, produção de AA é característica de outro patotipo de E. coli diarreiogênica, E. coli enteroagregativa. Neste trabalho, investigamos e comparamos características fenotípicas e genotípicas de 3 amostras AL/AA+ e 3 amostras AL+ do sorotipo. Dentre os aspectos fenotípicos, comparamos algumas atividades metabólicas (descarboxilação de L-lisina e fermentação de 8 açúcares distintos) e resistência a antimicrobianos, mas não houve um perfil que identificasse os grupos. Todas as amostras foram positivas no teste de Fluorescent Actin staining (FAS), que avalia indiretamente a capacidade de produzir lesão A/E, e as amostras AL/AA+ apresentaram acúmulo de actina tanto sob microcolônias compactas (AL), como sob agregados (AA). Todas as amostras foram capazes de aderir a superfícies abióticas, porém as amostras AL/AA+ apresentaram maior capacidade de formar biofilme que as AL+, o que sugere que as AL/AA+ tenham maior potencial patogênico. Dentre os aspectos genotípicos, avaliamos a origem filogenética das amostras por Multilocus sequencing analisys (MLSA), o que mostrou uma identidade de 100% entre as mesmas e a classificação dessas amostras no grupo filogenético B2. Analisando os perfis de bandas de DNA plasmidial observamos bandas comuns de alto peso molecular, porém não houve perfil de bandas comuns entre as amostras estudadas. Verificamos ainda que as amostras foram desprovidas de 34 genes descritos em patotipos de DEC. Como não encontramos qualquer característica que discriminasse os grupos, Realizamos também o sequenciamento do gene bfpA (que codifica a pilina de BFP) de uma amostra AL/AA+ (EC404/03) para analisar a hipótese desse gene codificar um pilina mais hidrofóbica que mediaria a adesão agregativa, porém o gene mostrou 99,9% de identidade com a sequência de bfpA de uma amostra protótipo do mesmo sorotipo. Para avaliar a participação do flagelo no estabelecimento do padrão híbrido e formação de biofilme, construímos um mutante desprovido do gene fliC, que codifica a flagelina (subunidade da haste), da amostra EC404/03. Esse mutante apresentou uma redução substancial na adesão a células ix HeLa e à superfície abiótica e na formação de biofilme, quando comparado com a amostra selvagem, porém não influenciou o padrão híbrido. Na tentativa de identificar se a expressão de AA estaria associada a um plasmídio comum, fizemos ensaios de conjugação com as amostras AL/AA+. As amostras EC404/03 e EC175/02 transferiram um plasmidio de ~80 kb para a E. coli não aderente, e o transconjugante resultante foi AA+, enquanto o transconjugante da amostra EC402/03 transferiu apenas o plasmídio EAF, responsável pelo padrão AL. Também realizamos a conjugação da amostra transconjugante GM-3 (derivada da amostra EC404/03) com uma amostra de EPEC típica AL+ do sorotipo O111:2, sendo que o transconjugante resultante recebeu um plasmidio de ~80 kb (pGM 80) e expressou AL/AA. O sequenciamento de pGM80 revelou a existência de uma variante do pilus tipo IV, responsável pelo fenótipo AA em amostras de EAEC. Este estudo ressalta a importância da transferência horizontal de genes que codificam o padrão AA em amostras de EPEC típica, uma vez que a habilidade de formar lesão A/E associada à capacidade de formar biofilme pode exacerbar a condição clínica do paciente e conduzir a persistência do processo de diarreia.

Escherichia coli Enteropatogênica (EPEC)
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) strains carry the EAF plasmid encoding the Bundle forming pilus (BFP), promote attaching/effacing lesions and produce localized adherence (LA) on HeLa cells. EPEC serotype O119:H6 producing LA (LA+) are frequent in our country, however, we isolated some EPEC O119:H6 producing LA and aggregative adherence (AA) concomitantly (LA/AA+). Interestingly, AA production is characteristic of another diarrheagenic E. coli pathotype, enteroaggregative E. coli. In this work, we investigated and compared phenotypic and genotypic characteristics of 3 LA/AA+ strains and 3 LA+ strains of the serotype. Among the phenotypic aspects, we compared various metabolic activities (L-lysine decarboxylation and fermentation of 8 different sugars) and antimicrobial resistance, but there was no specific profile to identify the groups. All strains were positive in the Fluorescent Actin staining test that indirectly evaluates the ability to produce A/E lesions and the LA/AA+ strains promoted actin accumulation under bacteria present in both the compact microcolonies (LA) and the aggregates (AA). All strains adhered to abiotic surfaces, but the LA/AA+ strains had greater ability to form biofilm than the LA+ strains, suggesting that the LA/AA+ strains have a higher pathogenic potential. Among the genotypic aspects, we evaluated the phylogenetic origin of the strains by Multilocus sequencing analysis (MLSA), which showed a 100% identity among the strains and the classification of these strains in the phylogenetic group B2. By analyzing the plasmid DNA profiles we observed common high molecular weight bands, however there was no common profile between the two groups of strains studied. We also found that the strains were devoid of 33 genes described in the DEC pathotypes. As we did not find any features that discriminated the groups, we also performed the sequencing of the bfpA gene (which encodes the BFP pilin) of a LA/AA+ strain (EC404/03) to analyze the hypothesis that this gene encoded a more hydrophobic pilin, thus mediating the aggregative adhesion, but the gene showed 99.9% identity with the bfpA sequence of a prototype strain of the same serotype. To evaluate the role of the flagellum in the establishment of the hybrid pattern and biofilm formation of the EC404/03 strain, we constructed a mutant devoid of the fliC gene, which encodes flagellin (the subunit of the rod). This mutant showed a substantial reduction in adherence to HeLa cells and abiotic surfaces and in biofilm formation, as compared to the wild-type strain. However, fliC deletion did not
Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC)
1
84
PORTUGUES
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

Contexto

BIOLOGIA CELULAR
ESTUDOS DE BIOLOGIA CELULAR, SINALIZAÇÃO, MECANISMOS DE PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA EM PATÓGENOS HUMANOS (VÍRUS, BACTÉRIAS, FUNGOS E TRIPANOSOMATÍDEOS) E NO CANCER
DETERMINANTES MOLECULARES E CELULARES DE PATOGENICIDADE EM ESCHERICHIA COLI

Banca Examinadora

TANIA APARECIDA TARDELLI GOMES DO AMARAL
Não
Nome Categoria
ROSA MARIA SILVA Docente
CRISTIANO GALLINA MOREIRA Participante Externo
MARCIA REGINA FRANZOLIN Participante Externo
CARLA TADDEI DE CASTRO NEVES Participante Externo

Financiadores

Financiador - Programa Fomento Número de Meses
FUNDACAO DE AMPARO A PESQUISA DO ESTADO DE SAO PAULO - Bolsa de Doutorado 48

Vínculo

Bolsa de Fixação
Instituição de Ensino e Pesquisa
Pesquisa
Sim