Streptococcus pneumoniae é responsável por várias infecções, desde otite média aguda e sinusite até outras mais graves como pneumonia, bacteremia e meningite, sobretudo em crianças. A colonização nasofaríngea por esta espécie é um fator chave para o desenvolvimento das doenças pneumocócicas e disseminação do microrganismo. Visando determinar a taxa de colonização por S. pneumoniae, foram analisados 242 espécimes nasofaríngeos coletados de crianças com idade inferior a seis anos assistidas em uma creche e um hospital de Niterói entre março e junho de 2010, os quais foram à época analisados por cultura direta (CD) em meio ágar sangue com 5,0 μg/mL de gentamicina. No presente estudo, as mesmas amostras foram analisadas por duas novas abordagens para avaliar a taxa de colonização, ambas envolvendo uma etapa prévia de enriquecimento em caldo, seguida de cultura em ágar sangue (CE) ou de PCR (PCR-E). Em todas as metodologias, a determinação dos sorotipos foi realizada por PCR multiplex sequencial, investigando-se a presença de 47 sorotipos. Aliadas, as três abordagens permitiram a detecção de colonização nasofaríngea em 141 crianças (58,3%), sendo mais frequente entre aquelas assistidas na creche (62,7% vs. 55%). Os métodos CD e CE permitiram identificar a presença do pneumococo em 49,2% (n=119) e 47,5% (n=115) das crianças, respectivamente, sendo que, em conjunto, o microrganismo foi detectado em um total de 123 crianças (50,8%). Já o método PCR-E foi mais sensível (p<0,0001), detectando a presença do pneumococo em 56,6% dos espécimes (137/242). Quatro amostras isoladas por métodos baseados em cultura foram negativas no PCR-E e outras 18 amostras positivas no PCR-E não foram detectadas pelos métodos de cultura. Foram identificados 26 sorogrupos/sorotipos distintos, predominando 6B, 19F, 14, 6A, 15C e 23F, sendo observada maior diversidade em crianças do hospital. Os sorotipos 6B e 19F foram os prevalentes na creche e no hospital, respectivamente. A colonização múltipla foi observada em 11 crianças, detectada principalmente por PCR-E. Entretanto, 19 pneumococos não tiveram o sorotipo determinado por nenhuma das abordagens, sendo considerados, então, não tipáveis (NT). A cobertura estimada de vacinas conjugadas disponíveis atualmente no Brasil foi baixa: aproximadamente 41% para a 10-valente (incluída no Programa Brasileiro de Imunizações em 2010) e cerca de 56% para a 13-valente (apenas em clínicas particulares). O rastreamento contínuo de portadores assintomáticos é útil para estimar e avaliar o impacto da implantação de um vacina, uma vez que a colonização nasofaríngea reflete os sorotipos circulantes responsáveis por doenças na população. Assim, a combinação de abordagens baseadas em cultura e PCR mostrou ser uma estratégia adequada para se obter uma visão mais realista da colonização pneumocócica em nosso meio.