O leite é considerado um alimento de grande importância pois é um dos alimentos mais consumidos no mundo e tem um grande valor econômico sendo o Mato Grosso um Estado com alta produção leiteira. Sua composição abrange diversos componentes, tais como: proteínas, gordura, cálcio, entre outros. No entanto, estes componentes tornam o leite, um meio favorável para o crescimento de microrganismos patogênicos e não patogênicos. A qualidade microbiológica do leite é um dos fatores mais controlados para que o alimento seja classificado como saudável, no entanto, microrganismos patogênicos podem contaminar o leite, podendo provocar doença nos consumidores. Escherichia coli é uma bactéria da família Enterobactericeae que coloniza o intestino de homens e animais, podendo apresentar patogenicidade, dependendo do seu sorotipo. E. coli pode causar quadro de toxinfecções nos consumidores e é encontrada com frequência em amostras de leite devido às falhas no processo de higiene na ordenha ou no beneficiamento industrial desta matéria prima. É uma bactéria que tem capacidade de formar biofilme, comprometendo a sua eliminação no ambiente industrial. Neste contexto, o presente estudo teve como objetivo verificar o comportamento de cepas E. coli previamente isoladas de amostras de leite cru através de kit comercial rápido de cultivo microbiológico, comparado ao isolamento por cultivo microbiológico tradicional associado ao teste bioquímico IMVIC, além de verificar a formação de fímbrias curli e biofilme nos isolados de E. coli confirmados. Para isso,40 cepas de E. coli previamente isoladas de amostras de leite cru diretamente colhidas em tanque de refrigeração mecânico por teste rápido de cultivo, foram testadas através do cultivo tradicional e teste bioquímico IMVIC. Foi verificado também a capacidade das cepas em produzir fimbrias curli e biofilme. Das 40 cepas previamente isoladas no teste rápido, 57,5% (23/40) foram confirmadas como E. coli no cultivo tradicional. Quanto à produção de biofilme, 65% (15/23) das amostras apresentaram esta capacidade. Em relação à produção de fimbria curli, dentre as 23 cepas de E. coli, 43,5% (10/23) apresentaram essa capacidade de produção quando incubadas a 28ºC por 48 horas e 30% (07/23) apresentaram esta capacidade, quando incubadas a 35ºC por 24 horas. Conclui-se que apesar da boa eficiência para diagnóstico rápido, o kit comercial não apresentou uma boa diferenciação entre as bactérias termotolerantes e E. coli mostrando uma concordância entre os testes de 57,49%, demonstrando a necessidade de realização de teste bioquímico para a diferenciação das mesmas. Conclui-se também que mais da metade das cepas de E. coli isoladas de leite bovino apresentaram a capacidade em produzir biofilme, demonstrando capacidade de resistência ao ambiente e no hospedeiro, realçando seu potencial de virulência.