A pecuária leiteira é uma das principais atividades do agronegócio brasileiro. Apesar do aumento na produção e consumo de leite, a produtividade dos rebanhos ainda é baixa. Dentre as causas de origem sanitária, destacam-se as mastites e as doenças reprodutivas. Em bovinos, Mollicutes são bactérias relacionadas a tais patologias sendo Mycoplasma bovis o agente de maior importância nas mastites, enquanto Ureaplasma diversum está associado a distúrbios reprodutivos. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de Mollicutes em leite e trato reprodutivo de vacas leiteiras, identificar alterações no leite decorrentes da colonização intramamária, determinar fatores de risco associados à colonização intramamária e genital e identificar genotipicamente cepas de ureaplasmas circulantes. Foram obtidas amostras de leite (n=387) e de suabe vaginal (n=392) de vacas em lactação de rebanhos do Sudeste brasileiro, estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro e São Paulo. O leite foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) para detecção de Mollicutes e de espécies de micoplasmas associadas à colonização intramamária, à contagem de células somáticas (CCS), análise microbiológica e de composição centesimal. O material de trato reprodutivo, à PCR para detecção de Mollicutes e de U. diversum. Concomitantemente, foi aplicado o questionário epidemiológico para analisar fatores de risco, avaliados pelo teste de Qui-quadrado, sendo as variáveis estatisticamente significativas submetidas ao odds ratio (IC=95%). As amostras positivas para U. diversum foram sequenciadas a partir da região intergênica 16S-23S rRNA. Mollicutes foram detectados em 21% (4/19) dos rebanhos e 4,1% (16/387) dos animais, sendo 1,3% (5/387) positivos para M. bovis e 2,8% (11/387) para M. arginini. Nas propriedades onde houve Mollicutes no leite, rebanho maior que 150 animais [OR=3,51 (IC 95%; 1,11-11,08)], ordenha manual [OR=9,97 (IC 95%; 2,80-35,49)] e ausência de linha de ordenha [OR=6,54 (IC 95%; 1,92-22,29)] foram fatores de risco; as concentrações de gordura (2,27±1,96 g/100g), extrato seco total (11,15±1,91 g/100g) e a CCS (1213,19±2151,98 CS/mL) foram superiores às propriedades onde não houve a detecção (p<0,05). Quanto ao material de trato reprodutivo, 45,4% (178/392) e 21,7% (85/392) das amostras foram positivas para Mollicutes e U. diversum, respectivamente. Rebanho maior que 100 animais [OR=1,95 (95% IC 1,28-2,98)], produção média de leite superior a 500kg [OR=5,79 (IC 95%; 2,31-14,48)], novilhas [OR=4,04 (IC 95%; 1,10-14,85)], raça Holandesa [OR=2,29 (IC 95%; 1,45-3,60)], uso de inseminação artificial associada à transferência de embriões [OR=1,42 (IC 95%; 1,20-1,69)] e histórico de doença reprodutiva [OR=2,28 (IC 95%; 1,37-3,80)] foram associadas à infecção por Mollicutes, enquanto rebanho maior que 100 animais [OR=1,91 (IC 95%; 1,12-3,27)] foi associada com a infecção por U. diversum (p<0,05). A frequência de detecção no leite foi baixa, sendo este o primeiro relato de M. bovis no Rio de Janeiro e de M. arginini nos estados estudados. No trato reprodutivo, a frequência dos agentes foi alta e diferentes cepas de U. diversum estão disseminadas pelos estados, provavelmente pela grande movimentação de animais. Os fatores de risco elencados sinalizam a necessidade de adoção de boas práticas de manejo para evitar a disseminação dos agentes em rebanhos bovinos leiteiros criados sob condições semelhantes.