O resfriamento de espermatóforos do camarão Penaeus vannamei com fins de inseminação assistida pode permitir o trânsito de gametas entre laboratórios de reprodução, facilitando a troca de material genético e o uso de linhagens melhoradas geneticamente. O presente trabalho realizou o resfriamento de espermatóforos de P. vannamei a 15 °C durante 24 e 48 horas. Foram avaliados três meios diluidores: Água de Coco em Pó (ACP), Óleo Mineral (OM) e Água do Mar Esterilizada (AME). Foram realizadas análises microscópicas para verificar a viabilidade aparente, através da análise de integridade de membrana com eosina-nigrosina e morfologia espermática. A inseminação assistida foi realizada após os dois períodos de resfriamento. Não foi observada interação estatística entre os tempos de 24 e 48 horas de resfriamento. Para viabilidade aparente e morfologia, as porcentagens de células viáveis e morfologicamente normais mantiveram-se acima de 60% e 70%, respectivamente, em todos os tratamentos e em ambos os tempos de resfriamento avaliados. Ao se avaliar os meios diluentes, observaram-se 74,9±9,20, 77,3±9,40 e 78,1±6,35% de células normais nos tratamentos OM, AME e ACP, respectivamente. A maior média da taxa de eclosão foi de 80,67±12,01%, observada no tratamento AME, que foi superior ao observado para o tratamento ACP, com 50,15±20,75%. A taxa de eclosão obtida pelo tratamento OM foi de 71,47±18,83%. Os espermatóforos de P. vannamei são capazes de manter boas taxas de viabilidade aparente, morfologia normal e eclosão após 48 horas de estocagem a 15 °C em óleo mineral, água do mar ou ACP®. Sendo a água do mar esterilizada o meio diluente mais eficiente, pois resultou em maior taxa de eclosão após inseminação artificial.