As abelhas são muito importantes para o ser humano e para o meio ambiente, em 12 função do papel fundamental que desempenham, através da polinização. Entretanto, 13 vem sendo relatada, em todo o mundo, uma diminuição significativa de colônias da 14 espécie Apis mellifera, causada por diversos fatores, entre eles, infecções virais. Para 15 estudo e diagnóstico de enfermidades causadas por vírus utiliza-se o cultivo celular in 16 vitro. Atualmente, existem apenas duas linhagens celulares de Apis mellifera, 17 entretanto, essas linhagens não estão disponíveis comercialmente, além de serem 18 permanentemente infectadas pelo vírus deformador de asas, o que impossibilita seu 19 uso, especialmente em pesquisas relacionadas às interações célula-patógeno ou 20 entre patógenos. Com base nisso, descrevemos técnicas para obtenção de uma nova 21 linhagem celular de abelhas, através da descrição de cinco agentes de imortalização 22 celular, e padronização de técnicas para a elaboração e manutenção de cultivos 23 primários dessa espécie. Atualmente, as técnicas de imortalização celular utilizadas 24 em cultivos celulares de insetos são adaptadas daquelas utilizadas em células de 25 mamíferos. Cada técnica apresenta vantagens, limitações, praticidades e implicações 26 genotípicas e fenotípicas. A escolha da técnica de imortalização é uma etapa 27 fundamental e desafiadora no desenvolvimento de uma linhagem celular, visto que ela 28 deve, idealmente, possibilitar longos períodos de viabilidade celular, com elevado 29 número de passagens, além de manter o genótipo e fenótipo das células semelhante 30 ou idêntico ao tecido original. Para a elaboração dos cultivos primários, foram 31 avaliados os meios Grace, Leibovitz e Schneider, suplementados com soro fetal 32 bovino e antibióticos. Foram, também, avaliadas técnicas para manutenção e 33 criopreservação de cultivos celulares originados de ovos e larvas de abelhas Apis 34 mellifera. Para manutenção, foram avaliadas técnicas de tripsinização, uso de 35 espalhador celular e também de centrifugação do conteúdo celular. Com relação à 36 criopreservação, foram avaliadas duas diferentes soluções de congelamento: a 37 primeira, composta de 10% de DMSO e 90% de soro fetal bovino, e a segunda 38 composta por 30% de meio de cultivo, 10% de DMSO e 60% de soro fetal bovino. 39 Através das técnicas descritas, foram desenvolvidos 79 cultivos celulares, com até 19 40 passagens, e com viabilidade celular de até 140 dias. Dentre os meios avaliados, a 41 utilização do meio Grace na elaboração de cultivos primários apresentou maiores 42 taxas de proliferação celular e replicabilidade, demonstrando ser uma ótima opção 43 para a aplicação das técnicas de imortalização celular. O objetivo desta dissertação 44 foi padronizar técnicas para o desenvolvimento de cultivos primários, de fácil e prática 45
utilização, com o intuito de posterior imortalização celular, visando o desenvolvimento 1 de uma ou mais linhagens celulares da espécie Apis mellifera.