Os estuários vêm sendo amplamente utilizados pela sociedade humana e o aumento populacional vem gerando uma pressão nesses ambientes, acarretando uma variedade de impactos ambientais. Muitos poluentes lançados no meio ambiente vêm ocasionando distúrbios ecológicos e causam alterações biológicas em vários níveis. O petróleo e seus derivados, incluindo os HPA´s, estão usualmente relacionados à contaminação em ambientes estuarinos. Testes de toxicidade em peixes são empregados para avaliar o grau de contaminação nesses ambientes utilizando enzimas de bitransformação. No presente trabalho foram utilizados enzimas de fase I, a Etoxiresorufina O-desetilase e de fase II, a Glutationa S-transferase, assim como a Catalase, uma enzima do sistema de defesa antioxidante em peixes da espécie Genidens genidens na determinação de grau de contaminação do Estuário do Rio Macaé por derivados de petróleo, assim como análises da concentração de HPA´s na água do estuário. Também foram realizados ensaios de exposição dos peixes à fração solúvel do óleo diesel em laboratório. As coletas foram realizadas ao longo de uma ano e as amostras de água do estuário revelaram a presença de apenas três exemplares de HPA´s e em baixas concentrações. Para as análises enzimáticas realizadas nos diferentes meses do ano, a atividade da GST variou de 1,43 a 6,79 µmol.min-1.mg ptn-1 entre os indivíduos analisados sendo observado no mês de julho de 2012 uma atividade significativamente superior (4,64 ± 0,40 µmol.min-1.mg ptn-1; P<0,05) em relação aos outros meses amostrados. A atividade da CAT variou de 8,53 a 109 µmol.min-1.mg ptn-1 durante o período amostral, sendo nos meses de maio a junho de 2012 observadas atividades enzimáticas significativamente superiores, com valores de 80,5 ± 5,74 e 83,85 ± 5,48 µmol.min-1.mg ptn-1. Já a atividade da EROD variou de 1,14 a 167,20 pmol.min-1.mg ptn-1 entre todos os indivíduos analisados tendo uma atividade significativamente superior nos meses de setembro de 2011 e abril de 2012, com valores de 111 ± 10,4 e 80,3 ± 53 pmol.min-1.mg ptn-1. Análises comparativas entre as atividades enzimáticas e aspectos biométricos e de gênero dos peixes indicaram uma relação inversa somente para a CAT nos aspectos biométricos. Os ensaios utilizando a fração solúvel do óleo diesel em diferentes tempos mostraram que para a GST e para CAT não houve diferença estatística em relação ao controle entre os tempos de exposição; já para a EROD ocorreu um aumento da atividade no tempo de 24h para os indivíduos expostos. Os resultados indicam que a EROD é um bom biomarcador para derivados de petróleo e a aplicação dessa enzima sugeriu um cenário de contaminação no estuário do rio Macaé.