O controle da qualidade e autenticidade do leite é de suma importância, devido ao amplo consumo desse alimento. Por isso, é fundamental o desenvolvimento e o aprimoramento de técnicas que identifiquem falhas e adulterações durante o processamento do produto. Os padrões para esse controle geralmente baseiam-se no leite bovino. No entanto, a procura por leite de outras origens, como bubalina e caprina, faz com que seja necessária também a análise de metodologias que possam ser aplicáveis a estas outras espécies. A incorporação do leite cru ao pasteurizado, de maneira intencional ou por falhas durante a pasteurização, pode propiciar a proliferação de micro-organismos patogênicos, entre eles Salmonella spp. e Listeria monocytogenes, que devem estar ausentes em alguns alimentos, dada a sua alta patogenicidade e os inúmeros surtos já relatados. Outra preocupação é a fraude por mistura de leite de diferentes espécies não declaradas no rótulo do produto, que além de lesar o consumidor pode representar um risco a saúde dos indivíduos que possuem condições alérgicas. Desse modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar métodos para a análise da qualidade e autenticidade de leite de diferentes espécies. Para isso, verificou-se a sensibilidade de metodologias para a detecção da fosfatase alcalina e, assim, o controle da pasteurização em leite bovino, bubalino e caprino. Ainda, avaliou-se a capacidade de detecção da fraude por adição de pequenas porcentagens de leite bovino incorporado ao bubalino e caprino por meio de uma Reação em Cadeia da Polimerase multiplex (mPCR) e verificou-se a cinética de crescimento de microbiano em leite submetido a diferentes condições de processamento e armazenamento. Por fim, também propomos a padronização de uma mPCR para detecção simultânea de DNA bovino, bubalino, Salmonella spp. e L. monocytogenes e a aplicação em amostras experimentalmente contaminadas e fraudadas. Nossos resultados demonstraram que, entre os testes usados para acusar a atividade residual da fosfatase alcalina, a metodologia proposta pela legislação brasileira foi a mais eficaz em identificar a presença de pequenas porções de leite cru nas amostras, ao passo que os demais foram menos sensíveis. Quanto a Reação em cadeia da Polimerase, comprovamos que esta pode ser utilizada para a investigação da fraude por mistura de leites de diferentes espécies, bem como para a identificação de L. monocytogenes e Salmonella spp., diminuindo o tempo e o custo das análises. Já sobre a cinética de crescimento microbiano no leite, constatou-se que esse alimento, por ser rico em nutrientes, comporta-se também como um excelente substrato para bactérias patogênicas que se proliferam em distintas condições de armazenamento, com influência de fatores como pH, temperatura e competição com a flora acompanhante. Portanto, a avaliação de metodologias para a identificação de fraude, falhas no processamento térmico, contaminação microbiana e a compreensão do crescimento de bactérias em matrizes alimentares, conforme o que foi realizado nesse estudo, é imprescindível para a autenticação do leite e a garantia da segurança alimentar, gerando não só conhecimento para o meio cientifico, mas para que medidas possam ser adotadas por órgãos fiscalizadores.