Análises genéticas baseadas em sequências nucleotídicas têm se mostrado muito relevantes para entender a diversidade críptica de anuros, especialmente quando reúne dados de múltiplos locos. Atualmente, o gênero Physalaemus possui 48 espécies reconhecidas e suspeita-se da presença de algumas espécies crípticas, ainda não descritas. Análises filogenéticas e citogenéticas sugeriram a existência de pelo menos duas espécies crípticas ainda não descritas, proximamente relacionadas filogeneticamente a Physalaemus cuvieri e a Physalaemus ephippifer, podendo chegar a sete o número de espécies nesse grupo. A ausência da informação sobre a localidade-tipo de P. cuvieri dificulta a revisão taxonômica desse complexo de espécies e, por isso, até o momento as espécies delimitadas com base em sequências de DNA passaram a ser referidas como Physalaemus sp. - clado Oeste do Pará, Physalaemus sp. - clado Viruá), Linhagens 1A, 1B, 2 e 3 de “P. cuvieri”, P. ephippifer. Uma dúvida que ainda persiste em relação ao número de espécies contidas nesse complexo se refere a P. ephippifer e à Linhagem 1 de “P. cuvieri”. Com base em sequências de DNA mitocondrial, foi identificada baixa distância genética entre P. ephippifer e a Linhagem 1 de “P. cuvieri”. No entanto, grande variação citogenética existe entre esses grupos, principalmente em relação a cromossomos sexuais, pois apenas P. ephippifer apresenta heteromorfismo sexual cromossômico. Para entender melhor a relação entre esses dois grupos, se torna de suma importância o estudo de espécimes que ocorrem nas áreas situadas entre as localidades de ocorrência da Linhagem 1 de “P. cuvieri” e de P. ephippifer. No presente trabalho, com base em sequências de DNA mitocondrial, marcadores do tipo RAD-seq e dados cariotípicos, foram analisados espécimes dessa região, com o intuito de avaliar a hipótese de contato secundário entre as linhagens mencionadas. Os resultados mostraram que existem dois haplogrupos mitocondriais dentre os espécimes daquela região, um deles agrupado com P. ephippifer e o outro com a Linhagem 1 de “P. cuvieri”. Todavia, os agrupamentos inferidos com base nos marcadores nucleares do tipo RAD-seq foram incongruentes com aqueles apontados pelos dados mitocondriais, levantando a hipótese de hibridação/introgressão envolvendo P. ephippifer e a Linhagem 1 de “P. cuvieri”. Os resultados citogenéticos revelaram um cariótipo exclusivo aos indivíduos da região em estudo, e nenhuma evidência da presença de híbridos de primeira geração foi encontrada. Assim, foi possível inferir que há evidência de contato secundário entre P. ephippifer e a Linhagem 1 de “P. cuvieri na área estudada” e que esse contato deve ter ocorrido há algum tempo.