A pitaya vermelha (Hylocereus polyrhizus) é uma fruta originária do México e América Central e do Sul, difundida em regiões subtropicais e tropicais. Em sua composição, a pitaya vermelha possui considerável quantidade de compostos fenólicos que possuem reconhecida atividade antioxidante. A interação entre compostos fenólicos e bactérias probióticas têm atraído o interesse da comunidade científica, pois por meio de biotransformações podem ser obtidas formas mais ativas destes compostos. O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos de L. acidophilus LA-05 e B. lactis BB-12 sobre o conteúdo, bioacessibilidade dos compostos fenólicos e capacidade antioxidante da fração dialisada (absorvível) da pitaya vermelha. A contagem de células viáveis e parâmetros associados ao metabolismo dos probióticos teste foram determinados após 48 h de cultivo em pitaya vermelha. A sobrevivência de L. acidophilus LA-05 e B. lactis BB-12 na pitaya vermelha fermentada em condições gastrointestinais simuladas foi também determinada, bem como os efeitos das cepas teste no conteúdo e bioacessibilidade dos fenólicos da pitaya vermelha utilizando um modelo de digestão acoplado a uma barreira intestinal simulada. A fração dialisada da pitaya vermelha fermentada foi avaliada quanto à capacidade de desativação de radicais oxigenados. Após 48 h de cultivo em pitaya vermelha, as contagens iniciais (aproximadamente 7 log UFC/mL) de L. acidophilus LA-05 e B. lactis BB-12 aumentaram (p < 0,05) 1.59 ± 0.18 e 1.43 ± 0.15 log UFC/mL, respectivamente. No mesmo período, os teores de açúcar e pH diminuíram (p < 0,05), enquanto o conteúdo de ácidos orgânicos aumentou (p < 0,05). Após a exposição a condições gastrointestinais simuladas, foram observadas contagens de L. acidophilus LA-05 e B. lactis BB-12 na pitaya vermelha fermentada, em torno de 8 e 7 log CFU/mL, respectivamente. De modo geral, a fermentação com as cepas probióticas reduziu (p < 0,05) o conteúdo da maioria de ácidos fenólicos e flavonóides na pitaya vermelha. L. acidophilus LA-05 aumentou (p < 0,05) o conteúdo dos ácidos clorogênico, gálico e siríngico, cianidina 3,5 diglicosídeo, procianidina B1 e procianidina B2, quercetina e rutina na fração não dialisada (não absorvível) enquanto B. lactis BB-12 aumentou (p < 0,05) o conteúdo dos ácidos caféico, clorogênico e siríngico e procianidina B1 nesta mesma fração. A bioacessibilidade do ácido caféico, catequina, galato de epigalocatequina, kaempferol 3-glicosídeo, procianidina B1 e procianidina B2 aumentou (p < 0,05) na pitaya vermelha fermentada por L. acidophilus LA-05. Aumentos (p < 0,05) da bioacessibilidade da catequina, galato de epigalocatequina e procianidina B2 também foram observados na pitaya vermelha fermentada por B. lactis BB-12. A fração bioacessível da pitaya vermelha fermentada por L. acidophilus LA-05 ou B. lactis BB-12 apresentou maior atividade antioxidante do que a pitaya vermelha não fermentada. Estes resultados mostram o impacto das cepas probióticas L. acidophilus LA-05 e B. lactis BB-12 sobre os compostos fenólicos na pitaya vermelha e sugerem que estes microrganismos podem ser utilizados como uma alternativa para aumentar o potencial antioxidante desta fruta, além de aumentar o conteúdo de fenólicos disponíveis na fração não dialisada.