O uso de biomoléculas para reparação de lesões ósseas é de extrema importância para a evolução da ciência, uma vez que torna mais eficaz e menos invasivo o tratamento de fraturas. Esse estudo verificou o efeito de esferas de quitosana e extrato de Mastruz, Dysphania ambrosioides (EBM) na regeneração óssea. Foram utilizados 60 ratos Wistar, machos e distribuídos em 4 grupos (n=15): Q (quitosana), QM5 (quitosana + 5% de EBM), (quitosana + 20% de EBM) e C (controle – coágulo sanguíneo). Em cada animal foi produzido um defeito ósseo na tíbia, onde foi depositado o biomaterial (Q, QM5 e QM20) ou mantido apenas o coágulo sanguíneo (C). Após 7, 15 e 30 dias, os animais foram sacrificados e os tecidos analisados em microscópio óptico para os eventos celulares: infiltrado inflamatório, necrose, fibroblastos, osteoblastos, osteoclastos e formação óssea periosteal e endosteal. A análise estatística foi realizada pelos testes de Kruskal-Wallis, Dunn e Mann-Whitney (p <0,05). Os resultados mostraram diminuição da intensidade celular diretamente proporcional ao tempo, exceto a formação óssea. Necrose tecidual significativa foi observada apenas com 7 dias (p=0,037). A presença de osteoclastos e fibroblastos se mostrou semelhante (p>0,05), sendo maior no período inicial. A presença de osteoblastos diferiu entre os grupos QM5 e Q (p=0,009), QM5 e QM20 (p=0,027) e QM5 e C (p=0,047) com 7 dias, com diminuição nos períodos subsequentes. A formação endosteal e periosteal foi maior no grupo QM20 (p=0,031) (p=0,047) em sete dias. Com 15 dias observou-se aumento significativo na formação óssea endosteal e periosteal, principalmente no grupo QM20 (p=0,001) (p=0,001), mantendo padrão semelhante com 30 dias com diferença com C (p=0,023) e Q (p=0,001) foi maior. As esferas de quitosana com extrato de Mastruz na concentração de 5% e 20% estimulou a regeneração óssea apresentando potencial para utilização como biomaterial.