O naftaleno possui elevada toxicidade e é metabolizado pela bactéria Pseudomonas putida G7 devido à presença do plasmídeo NAH7 que carrega os genes necessários para tal processo. Nesse organismo, as enzimas NahJ (4-oxalocrotonato tautomerase, 7,1 kDa), NahK (4-oxalocrotonato descarboxilase, 28,4 kDa) e NahL (vinilpiruvato hidratase, 27,9 kDa) pertencem à via inferior de degradação, sendo que NahK e NahL ocorrem in vivo como um complexo. O objetivo desse trabalho foi produzir mutantes da proteína NahK recombinante, alterando os resíduos K64, K72, K164, F151 e F153 para alanina. Buscou-se sua caracterização cinética e cristalográfica a fim de comprovar experimentalmente a importância dos resíduos para o mecanismo de ação da enzima NahK previamente proposto. Ainda, produzir a enzima NahJ, para obtenção de seu produto utilizado como substrato de NahK e, também, obter o complexo proteico NahK/NahL para análise por criomicroscopia eletrônica, permitindo comparação com resultados cristalográficos previamente obtidos. Os genes mutantes foram obtidos comercialmente (após diversas tentativas em laboratório), clonados no vetor pET28a-TEV e, assim como NahJ e NahK/NahL, expressos em Escherichia coli BL21(DE3) a 17 °C por 24 h. As células foram lisadas e a fração solúvel purificada. Foi visto que todos os mutantes propostos apresentaram atividade reduzida quando comparada à enzima nativa. Os parâmetros cinéticos de S164A indicaram menor afinidade da enzima mutada pelo substrato (KM = 24,84 μM) e redução da constante de especificidade (kcat/KM = 4,4 × 103 M-1s-1), corroborando a importância desse resíduo na catálise. Dados obtidos de criomicroscopia confirmaram o tamanho de NahK/NahL, estimado em cerca de 10 nm, e a formação dos pentâmeros previamente observados por cristalografia de Raios-X. Esses resultados auxiliam na comprovação do mecanismo enzimático previamente proposto para NahK e permitem estudos avançados para obtenção de modelos proteicos tridimensionais por meio de variadas técnicas.