O estudo avaliou as alterações na biometria testicular, parâmetros seminais, integridade do DNA e ligação da ram seminal vesicle protein (RSVP) às células espermáticas e o proteoma do do plasma seminal de carneiros submetidos à insulação escrotal intermitente. Seis carneiros Morada Nova tiveram seus testículos insulados intermitentemente por quatro noites consecutivas (18:00 às 6:00), totalizando 48 horas. O sêmen foi coletado por eletroejaculação de 14 dias antes a 120 dias após o início da insulação escrotal. A circunferência escrotal reduziu de 30,5 ± 0,34 cm (dia 0) para 27,9 ± 0,58 cm (dia 28) e sendo recuperada ao dia 57 (30,6 ± 0,62 cm). A motilidade espermática total reduziu de 75% (dia 0) para 33% (dia 4), estando ausente ao dia 23 e 28 após o início da insulação escrotal, retornando ao normal ao dia 77 (67%). O percentual de espermatozoides morfologicamente normais foi reduzido de 96% (dia 0) para 6% (dia 7) sendo reestabelecido ao dia 91 (87%). A integridade do DNA espermático alcançou menores valores entre os dias 11 e 63 (10,7%) retornando ao normal 120 dias após o início da insulação (80,4%). O percentual de espermatozoides imunomarcados com RSVP reduziu 20% após a insulação escrotal intermitente (pré: 54,9%; pós: 34,6%). Foram detectados 342 spots no gel máster, de modo que, 13 spots mostraram-se diferenciais e corresponderam a 14 proteínas, destes, nove tiveram sua expressão reduzida (Carboxypeptidase Q precursor, Beta-actin-like protein 2, Superoxide dismutase [CuZn], Mammaglobin A, Spermadhezin z-13, Epididymal secretory protein E1, Binder of sperm 5 precursor, Aldose reductase, Creactive protein) enquanto outros 5 spots tiveram sua expressão aumentada (Serum albumin precursor, Inhibitor of carbonic anhydraselike, Inactive ribonuclease-like protein 9, EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3 e Polymeric immunoglobulin receptor) devido a insulação escrotal. Portanto, a hipertermia escrotal resulta em alterações microscópicas e moleculares que reduzem a qualidade seminal em carneiros criados em clima tropical.